32份粳稻骨干親本抗稻瘟病基因的分子檢測

劉艷艷 曹婷 劉興華 嚴國紅

摘要：為明確Pi-ta和Pi9稻瘟病抗性主效基因在32份粳稻骨干親本中的分布狀況，利用抗稻瘟病基因Pi-ta和Pi9的分子標記對32份粳稻骨干親本進行檢測。結果表明，在32份骨干親本中，Pi-ta抗性基因檢出率為 46.88%，Pi9抗性基因檢出率為12.50%，同時檢測到Pi-ta和Pi9抗病基因，檢出率為3.12%，不含有Pi-ta和Pi9抗病基因的材料占比為43.75%。在骨干親本中，Pi-ta單個基因的檢出率較高，Pi9單個基因的檢出率較低，同時含有Pi-ta和Pi9抗病基因的材料較少，因此可見，多個抗稻瘟病基因的聚合育種是今后水稻抗病育種的重點。

關鍵詞：水稻;稻瘟病;Pi-ta;Pi9;分子檢測;抗性基因

中圖分類號： S511.2+20.1;S435.111.4+1文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2020）13-0069-03

收稿日期：2019-08-12

基金項目：江蘇沿海地區農業科學研究所基金（編號：YHS201610）。

作者簡介：劉艷艷（1990—），女，山東日照人，碩士，助理研究員，主要從事水稻育種及抗病性研究。E-mail：1052233980@qq.com。

通信作者：嚴國紅，研究員，主要從事水稻遺傳育種研究。E-mail：2376308693@qq.com。水稻（Oryza sativa）作為世界上重要的糧食作物之一，為全球超過1/2的人口提供糧食來源[1]。由稻瘟病病菌（Magnaporthe grisea）引起的稻瘟病是水稻生產中最具有毀滅性的病害，在我國幾乎所有水稻栽培地區都有稻瘟病害的發生，尤其是在南方稻區，曾多次出現稻瘟病大面積暴發事件，對我國的糧食生產造成了嚴重影響[2-3]。病原菌的生理小種多、變異強，能夠在短時間內適應水稻抗病品種（系）的遺傳抗性，導致很多抗病水稻品種（系）無法持久抗病，推廣種植數年后就導致抗性減弱或完全喪失。因此，利用抗病基因選育稻瘟病抗性品種是防治稻瘟病的有效手段[4]。在傳統水稻育種中，主要通過雜交系選結合抗病表型鑒定最終選育含有目標抗性的品種，依賴于育種者的育種經驗，往往容易造成誤差，導致抗性基因丟失，選擇效率低且周期長[5]。因此，利用分子生物學技術明確主栽品種和新選育品種的基因型，同時結合傳統育種手段，是抗病品種科學應用的前提。

迄今，水稻所有染色體上至少有69個抗稻瘟病位點被報道，包含84個主效基因，其中30多個抗稻瘟病基因已經被克隆[6]。許多與抗稻瘟病基因連鎖的分子標記被開發，Pi-ta是最早被克隆出來的抗稻瘟病基因之一，位于水稻第12號染色體靠近著絲點附近的區域，包含2個外顯子和1個長度為 1 463 bp 的內含子，編碼1個長度為928個氨基酸的細胞質膜受體蛋白，其分子標記也相繼被開發并廣泛應用于水稻抗稻瘟病分子育種中[7]。水稻抗稻瘟病基因Pi9來源于小粒野生稻，Qu等克隆了Pi9抗稻瘟病基因，并將該基因定位在水稻第6號染色體上，結果表明，接種多個稻瘟病病菌生理小種后表現出較高的抗性[8]。華麗霞等利用PCR技術及電泳檢測技術成功研發了稻瘟病抗性基因Pi2、Pi9及Piz-t的分子標記[9]。由此可見，利用水稻抗稻瘟病主效抗性基因Pi9的分子標記，有助于改良水稻對稻瘟病的抗性[10]。

本研究利用Pi-ta和Pi9抗病基因功能性分子標記，對32份粳稻育種骨干親本進行抗稻瘟病基因型檢測，旨在明確骨干親本的抗病基因型，為下一步選育新的抗稻瘟病品種組合提供依據。

1材料與方法

1.1試驗地點與材料

供試材料于2017年春季播種于江蘇沿海地區農業科學研究所南洋試驗農場（120°14′E，33°25′N）。供試材料為32份粳稻育種骨干親本，由江蘇沿海地區農業科學研究所提供，詳見表1，其中已經審定的品種為科騰稻2號、泗稻2333、云粳稻1號、鹽稻9號、揚育粳2號、蘇10-100、鹽稻1333和徐稻3號，其余材料為穩定的水稻品系。

1.2稻瘟病抗性基因Pi-ta和Pi9的分子標記

稻瘟病抗性基因Pi-ta、Pi9引物序列參照高利軍等的研究結果[11]，引物名稱、序列及其目的擴增片段長度等信息見表2，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3稻瘟病抗性基因Pi-ta、Pi9的檢測

采用十二烷基三甲基溴化銨（CTAB）方法提取水稻基因組DNA。以基因組DNA為模板進行基因片段擴增，PCR反應體系參照范方軍等的方法[12]。反應產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，用溴化乙錠染色，隨后在紫外凝膠成像儀上觀察并照相。

2結果與分析

2.1抗性基因Pi-ta的分子檢測

用抗稻瘟病基因Pi-ta的特異性引物對32份供試粳稻材料進行PCR擴增。圖1中的M為TaKaRa公司生產的DL2000 DNA marker，1～32對應表1中的品種（品系）。由圖1可以看出，有15個水稻品種（品系）擴增出1條稍大于1 000 bp的特異性條帶，分別是南粳5840、鎮稻449、科騰稻2號、淮粳1309、泗稻2333、淮780、云粳稻1號、皖墾粳218、鹽稻13180、揚育粳2號、蘇10-100、寧3817、連粳15214、揚輻粳5208、浙粳20，表明所用水稻品種（品系）中含有抗稻瘟病基因Pi-ta。攜帶Pi-ta抗性基因的水稻品種（品系）約占32份水稻品種（品系）的46.88%，說明Pi-ta抗性基因已經在水稻骨干親本中廣泛存在。

2.2抗性基因Pi9的分子檢測

用抗稻瘟病基因Pi9特異性引物對32份供試粳稻材料進行PCR擴增，圖2中的M為TaKaRa公司生產的DL1000 DNA marker，1～32對應表1中的品種（品系）。由圖2可以看出，只有4個水稻品種（品系）擴增出大小為291 bp的特異性條帶，分別是江稻159、蘇10-100、鹽稻1333、徐稻3號。攜帶 Pi9 抗性基因的水稻品種（品系）占32份水稻品種（品系）的12.50%，說明Pi9抗性基因在水稻骨干親本中的應用較少，應該加大對抗性基因Pi9的利用。

2.3抗性基因Pi-ta和Pi9的分布

由表3可以看出，在32份骨干親本中，Pi-ta抗性基因的檢出率為46.88%，Pi9抗性基因的檢出率為12.50%，同時檢測到Pi-ta和Pi9抗病基因的比例為3.12%，沒有檢測到Pi-ta和Pi9抗病基因的比例為43.75%。在骨干親本中，Pi-ta單個基因的檢出率較高，Pi9單個基因的檢出率較低，同時含有Pi-ta和Pi9抗病基因的材料較少。因此，在以后的水稻抗病育種中，應該加強多個抗稻瘟病基因的聚合利用。

3討論與結論

傳統的水稻抗病育種主要依靠水稻品種在田間的發病程度進行篩選，這種育種方法耗時費力，而且容易受到環境的影響。稻瘟病病菌具有多個生理小種，且變異速度較快，一些抗病水稻品種推廣 2～3年后表現出抗病性逐漸喪失的現象，因此，明確品種本身的抗性基因型對于品種的抗性改良尤為重要。隨著抗稻瘟病基因的克隆及分子標記的開發，通過分子標記輔助選擇檢測水稻是否含有抗病基因，合理選擇適宜在不同生態地區種植的抗性品種的方法，因具有準確、快速且不受環境影響等優點，已經被廣泛應用于育種實踐中。

近年來，國內外學者相繼對水稻品種的抗瘟基因型開展了研究。張銀霞等利用Pi-ta、Pi-b、Pi9對寧夏水稻種質資源進行了檢測，為寧夏水稻分子標記輔助育種奠定了基礎[13]。王軍等研究發現，Pi-ta和Pi-b基因的聯合效應與穗頸瘟抗性呈正相關，并且這種相關性比2個基因單獨存在時與穗頸瘟抗性的相關性要緊密[14]。王生軒等研究發現，在河南地區，水稻稻瘟病抗病基因Pi9和Piz-t在育種中利用得較為廣泛，Pi-ta利用得較少，今后河南省在水稻育種工作中應加強廣譜稻瘟病抗性基因的聚合育種和綜合利用[15]。馬繼瓊等研究發現，貴州禾通過長期的人工和自然選擇，Pi5和Pi-kh基因頻率相對較高，而Pi9和Pi2頻率較低[16]。范方軍等研究發現，Pi-ta、Pi-b、Pi54是水稻育種中重要的抗稻瘟病基因，表明抗稻瘟病基因Pi-ta和Pi-b與穗頸瘟抗性存在顯著相關性[12]。鄒德堂等研究發現，在黑龍江地區水稻抗稻瘟病基因Pi9具有很高應用價值，含有Pi9基因的材料，苗期和分蘗期的平均發病級別均為2.4級，不含有Pi9基因的材料，苗期和分蘗期的平均發病級別分別為5.1級和5.4級[17]。在本研究中，Pi-ta檢出率為46.88%，Pi9的檢出率為12.50%，因此在今后的育種中，可以適當加強對Pi9基因的利用。

本研究中，骨干親本廣譜抗病基因Pi9在供試材料中分布得較少，抗性資源沒有得到充分利用。因此，在以后的育種實踐中，可以利用遺傳多樣性的方法對稻瘟病進行防治，將不同類型的抗稻瘟病品種種植在同一地區，這樣可以避免抗稻瘟病品種在種植2～3年后其抗性逐漸喪失的現象，從而延長抗性品種的使用年限。此外，在后續研究中，應聚合不同抗性基因來提高抗性，避免單一抗病基因喪失。

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