不同來源血清對體外培養驢巨噬細胞的影響

梁鞏 張強 郭旭川 陳慧颯 王艷萍 曾維斌

摘要：為比較驢血清和胎牛血清對體外培養驢巨噬細胞的影響，采用含10%驢血清或胎牛血清的培養液進行驢巨噬細胞培養的對比試驗，分別在培養的1、4、7、10 d時觀察細胞的生長狀況，并用MTT法通過細胞吸光度檢測細胞活力;培養后4 d采用流式細胞儀檢測巨噬細胞的純度。結果表明，含10%驢血清培養液培養的驢巨噬細胞的分化能力優于胎牛血清;培養后1、4 d時，2種血清對巨噬細胞活力的影響沒有顯著差異，但培養后7、10 d，驢血清組的細胞活力顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01）高于胎牛血清組;培養后4 d，2組試驗中巨噬細胞的純度分別為（92.72±0.45）%和（81.16±2.13）%。綜上，驢血清組培養的巨噬細胞其分化能力、活力和純度均優于胎牛血清組，故更適合用于驢巨噬細胞的體外培養。

關鍵詞：驢;MTT法;同源血清;異源血清;巨噬細胞;分化能力;活力;純度;體外培養

中圖分類號：S822.1 文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2020）13-0072-04

收稿日期：2019-07-30

基金項目：國家自然科學基金（編號：31760643）;石河子大學高層次人才科研啟動項目（編號：RCZX201501）;新疆生產建設兵團塔里木畜牧科技重點實驗室開放課題（編號：HS201504）。

作者簡介：梁鞏（1993—），男，新疆且末人，碩士研究生，研究方向為動物繁殖與生物技術。E-mail：2731327322@qq.com。

通信作者：曾維斌，副教授，研究方向為動物繁殖與生物技術。E-mail：zwbdky@126.com。血清支持細胞生長及繁殖的能力是在細胞培養過程中評價血清質量的重要指標之一，血清的選擇對于細胞的培養有非常重要的意義[1]。血清中由于含有多種促細胞生長的營養成分及細胞因子，因此成為體外細胞培養液中的常用添加成分，其對細胞的培養意義重大。細胞培養液中，常用的血清主要來源于牛、豬、雞等，其中胎牛血清因其獲得量大、污染相對較小而得到廣泛地應用，但不同來源的血清對不同的細胞培養效果各有差異[2-3]，來自同種動物的同源血清體外培養的細胞，其分化能力與貼壁能力均顯著優于異源血清培養的細胞，另外同源血清的應用可減少向培養液中添加較為昂貴的細胞生長因子[4-6]。

巨噬細胞作為重要的免疫細胞，是機體免疫反應的第1道防線[7-8]。它也參與穩態調節，包括纖維化、脂質代謝和組織重塑[9]，巨噬細胞的分離與培養可為免疫學研究提供基礎的細胞材料。目前，有大量試驗對牛、鼠、猴等巨噬細胞進行研究[1，4，6]，但有關驢巨噬細胞的分離及培養尚未見報道，因此本研究以驢外周血來源的巨噬細胞為試驗對象，比較含10%驢同源血清與10%胎牛血清的細胞培養液對體外驢巨噬細胞培養的影響，以便建立一種體外培養驢外周血單核巨噬細胞的方法。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑淋巴細胞分離液、MTT試劑盒、青霉素鏈霉素混合溶液，均購自于Solarbio公司;DMEM培養基（Hyclone）、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶消化液，均購自于Gibco公司;M、CD14抗體（美國BD公司）。

1.1.2試驗動物新疆石河子大學試驗站驢場體質量一致、體況較好的新疆母驢。

1.2方法

1.2.1驢血清的制備選擇健康母驢3頭，采用真空無抗凝劑采血管于頸靜脈采集全血，室溫靜置 30 min，3 000 r/min離心10 min，取淡黃色上清液，采用0.22 μm濾菌器過濾除菌，56 ℃水浴15 min，最后冷凍保存于-20 ℃下。

1.2.2外周血單核細胞（PBMCs）的分離、培養將采集的全血用磷酸緩沖鹽溶液（PBS緩沖液）等倍稀釋混勻后，緩慢加到淋巴細胞分離液上層（兩者的體積比為1 ∶1），1 800 r/min 離心30 min，采用移液器吸取血漿稀釋液與淋巴細胞液中間的PBMCs層，將獲得的PBMCs用PBS緩沖液等倍稀釋混勻，1 000 r/min離心10 min，去除上清液，將沉淀的PBMCs再用PBS緩沖液洗1次，最后采用DMEM培養液清洗1次后將沉淀的PBMCs用培養液混勻，細胞計數器計算細胞的濃度，將PBMCs置于含10%驢同源血清或胎牛血清的DMEM培養液的96孔培養板中培養，約為1×105個/孔，4 h后吸棄細胞液，除去未貼壁細胞，在加入含血清的DMEM培養液繼續培養并定時觀察細胞形態。每隔2 d更換相對應的培養液。

1.2.3MTT法檢測細胞的活力在巨噬細胞培養后1、4、7、10 d，吸棄細胞培養液，加90 μL新鮮含血清DMEM培養液，再加入10 μL MTT溶液，CO2培養箱孵育4 h，然后吸棄上清，加入110 μL甲臜（formazan）溶解液，置于搖床低速振蕩10 min，然后采用酶聯免疫檢測儀測量各孔的吸光度（D490 nm）。

1.2.4巨噬細胞純度的檢測在細胞培養后4 d，吸除細胞培養液，用PBS緩緩沖洗2遍貼壁細胞;然后加入0.25%胰蛋白酶消化10 min，在倒置顯微鏡下觀察細胞絕大部分懸浮收縮變圓后，分別加入對應的培養液終止消化;離心收集所有細胞，加 400 μL PBS緩沖液混勻，再加入CD14抗體15 μL（空白組未加），在4 ℃冰箱中避光孵育30 min，1 000 r/min 離心5 min棄液，再用PBS混勻、離心洗滌2次;最后每管加入PBS 400 μL重懸細胞后，采用流式細胞儀檢測細胞的純度（CD14表達陽性率）。

1.2.5數據分析采用SPSS 19.0軟件的單因素方差分析對數據進行統計學處理，所有試驗至少重復3次，結果采用“平均值±標準差”表示，P<0.05或P<0.01分別表示數據間差異顯著或極顯著。

2結果與分析

2.1不同血清對細胞生長形態的影響

由圖1可知，在顯微鏡下觀察發現，培養1 d時2組細胞形態均為顆粒狀且數量很多。在細胞培養后4 d，胞體明顯增大，細胞已經出現分化，胞體由顆粒狀向長梭狀或不規則形狀生長，眼觀2組間無太大差異。然而在培養后7 d，2組均可見偽足出現（箭頭所指方向），且驢血清組的分化能力優于胎牛血清組，另外2組細胞數量相比于培養后1 d明顯減少。在細胞培養后10 d，驢血清組的分化更加成熟，但胎牛血清組中的細胞無論是分化能力還是數量均在下降。

2.2不同血清對細胞活力的影響

由圖2可知，經MTT法檢測，隨著培養時間延長，2組的細胞活力均在逐漸降低。培養后4 d的2組細胞活力均顯著低于培養后1 d的細胞活力（P<0.05），且胎牛血清組在培養后1、4、7、10 d的細胞活力均有顯著差異（P<0.05）。

培養后1、4 d，2組的巨噬細胞活力沒有顯著差異，但在培養后7、10 d，驢血清組的細胞活力均顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01）高于胎牛血清組。

2.3驢巨噬細胞純度的檢測

由圖3可知，采用含10%驢同源血清、胎牛血清培養的驢巨噬細胞4 d CD14表達陽性率分別為（92.72±0.45）%、（81.16±2.13）%，驢同源血清培養的驢巨噬細胞 CD14表達陽性率顯著高于胎牛血清培養的驢巨噬細胞。

3討論與結論

巨噬細胞在炎癥反應和宿主防御中發揮核心作用，促進先天免疫的建立，所以它得到了廣泛研究[7-9]。分離培養單核巨噬細胞的方法多種多樣，如從骨髓、腹腔、外周血中均可成功地分離培養巨噬細胞[10-12]。從外周血中分離出來的單核細胞具有很強的貼壁能力，而且容易在體外誘導分化為單核巨噬細胞。這種通過外周血單核細胞分化的巨噬細胞已被廣泛用于科學研究工作中，是一種普遍被科研工作者接受的原代巨噬細胞模型。楊菲菲

利用不同仔豬血清濃度體外培養金華豬細胞表明，在10%仔豬血清濃度培養的細胞其傳代活力強、增殖迅速，含10%血清濃度的培養液更適合原代細胞的培養[13]，因此本試驗采用含10%血清濃度的培養液培養細胞。體外培養恒河猴外周血單核巨噬細胞時發現，猴同源血清優于胎牛血清[6]，貼壁細胞分化能力更強，胞體由顆粒狀向長梭狀或不規則形狀生長，胞體由顆粒狀逐漸伸出偽足，說明該方法培養的巨噬細胞已經具備了巨噬細胞的基本特征[14]。以上結論與本試驗相一致，表明同源血清比異源血清更能誘導細胞的分化能力。可能由于血清內含有各種刺激或抑制細胞生長因子，在一定程度上起著保持或改變細胞生物學特性的作用[15]。

細胞相對衰減是衡量血清相對促細胞生長作用的一種評價方法[16]。在研究其他外周血單核巨噬細胞體外培養時，細胞培養的前幾天是細胞的適應期，細胞數量變化比較大。一方面，細胞從體外分離過程中受到損傷并且要適應新的環境，所以有大量的細胞死亡。另一方面，在換液的過程中淋巴細胞被洗棄了。因此，采用MTT法檢測細胞活力時發現細胞活力逐漸下降，并且剛開始下降速度差異比較大[16-18]。沈前程等采用MTT法檢測培養貼壁單核巨噬細胞的相對活力，結果顯示，貼壁細胞體外培養72～120 h時，細胞數量相對穩定，組間差異不顯著（P>0.05）[18]。本研究也采用MTT法檢測驢巨噬細胞活力，結果表明，細胞在培養后4、7 d，兩者差異不顯著，因此可在細胞培養后4～7 d這一相對平穩期開展后續的試驗研究。

林煒明等在用10%人血清及人M-CSF培養人外周血巨噬細胞中發現，通過免疫磁珠分選后得到CD14的陽性率為85.5%[19]。盡管這些方法也能分離出巨噬細胞，但分離出來的成本更高，因此本試驗采用同源血清進行培養，省去無需添加生長因子和免疫磁珠分選等步驟，采用流式細胞儀檢測的單核巨噬細胞純度為（92.72±0.45）%。猴巨噬細胞在培養后4、7 d的CD14細胞的陽性率分別為（91.7±2.33）%、（96.4±1.93）%[6]，本研究結果與之相似，表明同源血清培養巨噬細胞是一種可行的方法。

綜上所述，驢血清組培養的巨噬細胞的分化能力、活力和純度均優于胎牛血清組，故更適合于驢巨噬細胞的體外培養，而究竟同源血清中哪幾種成分起了重要的作用，還須作進一步相關試驗研究。

參考文獻：

[1]張寶紅，鐘恒祿，盧惠芳，等. 應用MTT比色法評價不同牛血清促細胞生長作用[J]. 中國畜牧獸醫，2009，36（5）：84-86.

[2]Yilmaz M，Ovali E，Akdogan E，et al. Autologous serum is more effective than fetal bovine serum on proliferation of bone marrow derived human mesenchymal stem cells[J]. Saudi Medical Journal，2008，29（2）：306-309.

[3]宋玨，路通，謝林，等. 黃連解毒湯抗氧化作用的血清藥理學研究[J]. 中國實驗方劑學雜志，2010，16（4）：118-122.

[4]王宵，黃國彪，陳俊，等. 不同同源血清對體外培養小鼠骨髓基質細胞的影響[J]. 廣東藥科大學學報，2018，34（5）：618-622.

[5]傅欣，段小寧，張繼英，等. 同源血清與胎牛血清培養兔關節軟骨細胞的生物學特性[J]. 中國組織工程研究，2012，16（46）：8599-8606.

[6]桑明，代明，周立，等. 恒河猴外周血單核巨噬細胞體外培養方法的建立[J]. 中國實驗動物學報，2015，23（1）：18-24.

[7]Wynn T A，Chawla A，Pollard J W. Macrophage biology in development，homeostasis and disease[J].Nature，2013，496（7446）：445-455.

[8]Ginhoux F，Jung S.Monocytes and macrophages：developmental pathways and tissue homeostasis[J]. Nat Rev Immunol，2014;14（6）：392-404.

[9]Morón-Calvente V，Romero-Pinedo S，Toribio-Castelló S，et al. Inhibitor of apoptosis proteins，NAIP，cIAP1 and cIAP2 expression during macrophage differentiation and M1/M2 polarization[J]. PLoS One，2018，13（3）：e0193643.

[10]任凱夕，趙詣林，金超，等. 小鼠骨髓來源巨噬細胞體外培養及極化相關實驗方法的建立[J]. 細胞與分子免疫學雜志，2013，29（3）：310-313.

[11]吳春芳，劉崇武，游曉慶，等. 兔不同部位單核/巨噬細胞的分離、培養和鑒定[J]. 細胞與分子免疫學雜志，2011，27（5）：576-578.

[12]楊志梅，符州，王莉佳，等. 人外周血單核巨噬細胞誘導、培養及鑒定[J]. 生物學雜志，2008，25（5）：66-68.

[13]楊菲菲，屠平光，馬美蓉，等. 不同仔豬血清濃度對金華豬耳緣組織成纖維細胞體外培養的影響[J]. 畜禽業，2018，29（9）：5-6，8.

[14]Sha Z，Wang L，Sun L，et al. Isolation and characterization of monocyte/macrophage from peripheral blood of half smooth tongue sole （Cynoglossus semilaevis）[J]. Fish & Shellfish Immunology，2017，65：256-266.

[15]段小寧，張繼英，傅欣，等. 應用同源血清培養大鼠關節軟骨細胞生物學行為研究[J]. 中國運動醫學雜志，2011，30（3）：244-249.

[16]黃柏英，彭聰，祝和成. 應用MTT比色法評價新生小牛血清對培養細胞生長的影響[J]. 中南大學學報（醫學版），2004，29（2）：236-237.

[17]Jeanne M S，Kenneth W W，Tarwater P M，et al. SIV replication is directly downregulated by four antiviral miRNAs[J]. Retrovirology，2013，10（1）：95.

[18]沈前程，林瑩，王樹艷，等. 水牛外周血單核巨噬細胞的培養與鑒定[J]. 中國畜牧獸醫，2011，38（8）：31-35.

[19]林煒明，戴愛玲，尹會方，等. 人外周血巨噬細胞培養及功能鑒定[J]. 中國免疫學雜志，2015（1）：86-89.李倩，郭九峰，高海榮. 高壓靜電場脅迫對甘草生長過程中RNA的影響[J]. 江蘇農業科學，2020，48（13）：76-80.doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2020.13.015