白樺BpPR1基因生物信息學分析

安玉婷 李然紅 陳鑫 劉丹

摘要：利用生物信息學方法，對白樺BpPRI理化性質、親水/疏水性、跨膜結構、二級結構、三級結構及與其他植物PRI蛋白的同源性進行了預測，同時對該基因啟動子的順式作用元件以及基因結構進行了預測和分析。結果表明，①BpPR1的cDNA全長為816 bp，CDS為53lbp，編碼由176個氨基酸構成的穩定親水性蛋白，存在跨膜運輸結構，屬于CAP蛋白家族的一員。白樺BpPR1與葡萄、棗親緣關系較近;②BpPR1基因組結構中含有2個外顯子和3個內含子;③BpPR1啟動子含有多個真核生物啟動子的基本元件CAAT-box和TATA-box，還含有與低溫響應、脫落酸響應、茉莉酸甲酯響應、生長素響應、水楊酸響應、細胞分裂素響應相關的響應元件以及MYBHvl結合位點等，說明該蛋白可能受多種生長調節劑調控，參與生物與非生物脅迫過程。

關鍵詞：白樺（Betula platyphylla）;病程相關蛋白;生物信息學

中圖分類號：Q789

文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（ 2020）12-0171-04

DOI：10.1408 8/j .cnki.issn0439-8114.2020.12.038

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

白樺（Betula platyphylla）為樺木科樺木屬落葉木本植物，在亞歐大陸中分布較多。而在中國，其主要分布于東北、華北及西北等地區[1]。白樺具有適應能力強、生長快、材質優等特點，已成為當今社會最有應用價值及發展潛力的樹木種類之一，對白樺相關研究也越來越受到重視[2]。同時，白樺形態優美、表面光潔，常作為城市綠化樹種[3]。白樺皮及白樺汁具有很高的藥用價值，近年來，白樺已被列入重點的科技研究項目之一[4]。植物病程相關蛋白（Pathogenesis—related protein，PR）是植物在生物或非生物脅迫下產生的一類抵御不良環境的蛋白總稱。PR蛋白最早在煙草中被發現，在病毒侵染植株后產生，并且在侵染及未侵染部位PR基因都有大量表達[5]。PR廣泛存在于動物、植物中，在單子葉和雙子葉植物中存在更為廣泛，由17個蛋白家族組成，其中，已被發現功能的有PR2（β一1，3一葡聚糖酶）、PR3（幾丁質酶）、PR5（類甜蛋白）、PR6（蛋白酶抑制劑）、PR7（蛋白內切酶）、PR9（過氧化物酶）、PRlO（類核糖核酸酶）、PR12（防衛素）、PR13（硫素）、PR14（脂質轉運蛋白）等。當植物受到病原體感染時，PR的表達量顯著提高[6-8}。PR1作為病程相關蛋白家族成員之一，現已經被證實具有抵抗真菌入侵、限制病毒擴散及抵御逆境脅迫能力等功能。白樺類病斑突變體Imd對半知菌亞門的鏈格孢菌[ Alternaria alternata（ Fr.） Keissler]具有顯著抗性，BpPR1基因表達量在病原菌入侵時顯著提高。[9]。

本研究參考白樺轉錄組和基因組數據[10]，獲得白樺BpPR1基因的序列信息，利用生物信息學方法對其理化性質、疏水性/親水性、蛋白結構功能域、二級結構、三級結構、蛋白質修飾位點及同源性等進行了預測，對其基因結構進行分析，并與其他植物PR1基因結構進行了比較，為進一步研究該基因的功能及其表達調控機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料來源

白樺BpPR1基因啟動子和基因序列從CoCe網站獲得（ https：//genomevolution.org/coge/）。擬南芥（Arabidopsis thaliana）、葡萄（Vitis vinifera）、核桃（Juglans regia）和毛果楊（Populus trichocarpa）的基因結構信息從CoGe網站獲得。葡萄、棗（Ziziphusjujuba）、榴蓮（Durio zibethinus）、毛白楊（PoprLILLs to-mentosa）、橡膠樹（Hevea brasiliensis）、耬斗菜（Aquile-gia viridiflora）、豇豆（Vigna unguiculata）、菜豆（Phaseolus vulgaris）、核桃（Juglans regia）、可可（Theobroma cacao）、鼠尾草（Herrania umbratica）、紅車軸草（Trifolium pratense）、花芽龍眼（Dimocarpus longan）、克萊門柚（Citrus clementina）、毛果楊（Popu-lus trichocarpa），木豆（Cajanus cajan）、栓皮櫟（Quer-cus suber）等植物基因信息在NCBI（ https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）數據庫中獲得。

1.2 方法

本研究中用到的軟件及網址見表1。

2 結果與分析

2.1 白樺BpPR1基因結構分析

利用在線軟件GSDS（http：//gsds. cbi. pku. edu.cn）[11]對BpPR1基因結構進行分析，并與擬南芥、葡萄、毛果楊、核桃等植物的PR1基因結構進行比較。結果（圖1）表明，BpPR1基因中有3個內含子和2個外顯子，CDS為531 bp;毛果楊、擬南芥PR1基因中都含有一個外顯子和兩個內含子，CDS長度為485 bp;葡萄PR1基因的CDS也為485 bp，但沒有內含子;核桃PR1基因沒有內含子，CDS為503 bp;擬南芥、葡萄、毛果楊PR1基因的CDS都是485 bp，其基因結構的差別在于內含子不同。

2.2 白樺BpPR1理化性質預測

利用ProtParam軟件對白樺BpPRI的氨基酸序列進行分析，結果表明，BpPR1基因cDNA全長為816 bp，基因編碼區（CDS）為cDNA序列中第37至661個堿基，共編碼176個氨基酸，分子質量19 265.90D，理論等電點為8.93，負電荷殘基總數（Asp+Clu）為10，正電荷殘基總數（ Arg+Lys）為15，分子式為C842：H1312 N246，O250，S12，總原子數2 662，不穩定指數（Instability index，Ⅱ）為31.7，脂肪系數（Aliphatic in-dex）為1.36，平均親水性（GRAVY）水平為-0.178，說明該蛋白為穩定的親水性蛋白。該蛋白中含量最多的氨基酸為纈氨酸，占1 1.4%，其次為甘氨酸，占9.7%，含量最少的為谷氨酸和苯丙氨酸，分別為1.7%和1.1%。通過ProtScale軟件分析預測，該蛋白質整個肽鏈中均含有親水性和疏水性氨基酸，得分最大值為3.311，在第11個氨基酸處，最小值為-2.656，在第265個氨基酸處，氨基酸的負值分值大，根據蛋白質親水和疏水的得分判定該蛋白為親水性蛋白（圖2）。

2.3 BpPR1信號肽和跨膜結構分析

通過SignaIP-4.1預測BpPRI信號肽及跨膜結構，結果（圖3）表明，原始剪切位點的分值（C值）在第25個氨基酸時有最大值，為0.445，信號肽的分值（S值）在第14氨基酸時有最大值，為0.990，綜合剪切位點的分值（Y值）在第25個氨基酸時有最大值，為0.644，其D-cut off為0.717 06（>0.5），表明BpPRI蛋白含有信號肽，存在跨膜運輸結構。

2.4 BpPR1二級、三級結構預測

蛋白質二級結構是指肽鏈由氫鍵構成有規則的卷曲折疊具有周期性的空間結構，使用SOPMA對白樺BpPRI二級結構進行分析預測。結果表明，該蛋白9.83%可能會形成螺旋（Helix），27.12%可能形成延伸鏈（ Strand），4.14%可能形成轉角（Turn），58.64%為無規卷曲（Random coil），無二硫鍵的形成，沒有特殊的二級結構。用SWISS-MODEL對BpPR1蛋白進行三級結構的預測（圖4），不同類型二級結構進一步折疊，形成具有空穴的高級結構，可能是某些互作物質的結合位點。

2.5 氨基酸序列同源性對比

在NCBI數據庫中分別搜索葡萄、棗、榴蓮、毛果楊、榴蓮、橡膠樹、耬斗菜、豇豆、菜豆、核桃、可可、鼠尾草、紅車軸草、花芽龍眼、克萊門柚、毛果楊、木豆、栓皮櫟等17種植物的PRI序列，與白樺BpPRI氨基酸序列進行同源性分析。結果（圖5）表明，病程相關蛋白BpPRI與葡萄、棗親緣關系較近，而與榴蓮、毛白楊等植物親緣關系較遠。

2.6 白樺BpPR1基因啟動子序列分析

利用PlantCare對白樺BpPR1基因啟動子順式調控元件進行分析。結果（表2）表明，BpPR1基因含有多個真核生物啟動子的基本元件CAAT-box和TATA-box，含有茉莉酸甲酯響應的順式作用元件、光響應順式作用元件、低溫響應的順式反應原件、脫落酸響應的順式作用原件、MYBHvl結合位點、生長素響應的順式作用元件、水楊酸響應的順式作用元件、細胞分裂素的順式作用元件等，說明PR1基因與逆境脅迫密切相關。乙烯（ET）、茉莉酸（JA）、水楊酸（SA）是誘導產生抗病性重要的信號分子，可誘導植物中PRI的表達[12，13]。白樺BpPR1基因與多種植物生長調節劑響應有關。

3 小結與討論

病程相關蛋白是植物中一類重要的蛋白，植物在受到病原體侵染時，水楊酸（ Salicylicacid，SA）、茉莉酸（ Jasmonicacid，JA）、乙烯（Ethylene，ET）等生長調節劑含量會隨之改變，同時PR基因會選擇性表達‘14.15]。PR1作為病程相關基因重要的一員，對其結構功能的研究也在逐步進行。侯麗霞等[16]研究表明葡萄PRI可對多種脅迫產生響應應答，霜霉病菌、低溫、鹽、干旱、水楊酸、脫落酸、茉莉酸、一氧化氮、過氧化氫和硫化氫等可誘導其大量表達。馬立功等[17]對向日葵的研究發現PR1在鹽脅迫、干旱脅迫、核盤菌及其代謝產物的誘導下可上調表達，將該基因轉接到煙草中，獲得轉基因煙草，轉基因植株也提高了對核盤菌的抗性。PR1基因的表達受多種基因調控，PR1基因是否具有抗病性與其基因結構有關。張凱敏等[18]研究發現剛毛檉柳的TbPR1基因的編碼區長為537 bp，共編碼178個氨基酸，與白樺BpPR1較為接近。Li等[19]研究發現葡萄中煙草野火病菌只有在堿性PRI存在的情況下才不表達;Bonasera等[20]將PR1基因轉入到蘋果中，發現蘋果植株并沒有表現出對相應病菌的抗性。PR蛋白基因不僅具有一定的抗病功能，同時對植物生長、抵抗逆境脅迫、抗植株衰老及生長調節劑誘導等方面同樣發揮著至關重要作用。

本試驗利用生物信息學方法對BpPR1的基因結構、啟動子順式作用元件、理化性質及同源性等進行分析比較。結果表明，BpPR1的cDNA全長為816 bp，CDS為531 bp，編碼176個氨基酸，理論等電點為8.93，為堿性蛋白質，理論上具有較高的抗菌性。對其同源性進行比對，BpPRI與葡萄、棗親緣關系較近。BpPR1基因結構中含有3個內含子和2個外顯子，與擬南芥、毛果楊等PR1基因結構有所不同，但其編碼區大小差別不大。PR蛋白是受多基因調控的蛋白質，不同植物的表達量存在相對差異。對啟動子順式反應原件進行分析得到，BpPRI中含有茉莉酸甲酯響應的順式作用元件、光響應順式作用元件、低溫響應的順式反應原件、脫落酸響應的順式作用原件、MYBHvl結合位點、生長素響應的順式作用元件、水楊酸響應的順式作用元件、細胞分裂素的順式作用元件等，說明BpPRI參與多種植物生長調節劑的應答，該蛋白如何通過生長調節劑響應調控白樺抗病性還有待進一步研究。

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基金項目：國家自然科學基金項目（31800558）

作者簡介：安玉婷（1991-），女，黑龍江安達人，在讀碩士研究生，研究方向為植物學，（電話）18904534279（電子信箱）swxanyuting@126.com;通信作者，李然紅，（電話）18504539007（電子信箱）swxlrh@126.com。