商洛蕨菜總黃酮體外抗氧化活性研究

張曉文 鄭思琪

摘要：以2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）為陽性對照，利用紫外-可見分光光度計測定不同濃度梯度的蕨菜總黃酮樣品溶液來探究其對1，1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）、羥基自由基（·OH）、超氧陰離子（O-2·）的清除能力以及總還原力，探究商洛野生蕨菜總黃酮的抗氧化活性。當樣品溶液濃度達到4.0 mg/mL時，對DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子的清除率分別達到55.34%、71.30%、81.00%，總還原力的吸光度為0.735。試驗結(jié)果表明，商洛野生蕨菜總黃酮具有較強的體外抗氧化活性，其抗氧化活性的強弱與其質(zhì)量濃度呈正相關關系，在試驗濃度范圍內(nèi)，總黃酮的抗氧化活性低于BHT。

關鍵詞：蕨菜;總黃酮;抗氧化活性;自由基

中圖分類號： S647.01;TQ914.1;R284.2文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2020）13-0225-03

收稿日期：2019-08-14

基金項目：陜西省教育廳專項（編號：18JK0246）;商洛學院橫向科研項目（編號：19HKY003）;陜西省大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項目（編號：S201911396025）。

作者簡介：張曉文（1980—），女，陜西商洛人，碩士，副教授，主要從事中藥學研究。E-mail：510080487@qq.com。蕨菜屬鳳尾蕨科蕨屬多年生草本植物，別稱如意菜、龍頭菜、拳頭菜、商芝等，在我國各地都有分布。蕨菜味道甘甜、性味寒涼，具有清熱、滑腸、降氣、祛風、化痰的功效，以治療食隔、氣隔、腸風熱毒等癥為主，對于女子紅崩白帶、男子咳嗽、泄痢腹痛、發(fā)熱不退、濕疹等方面有很好的療效[1]。蕨菜含有多種人體所需的營養(yǎng)成分，例如脂肪、多糖、黃酮、蛋白質(zhì)、碳水化合物和Ca、Fe、Zn等微量元素[2]，尤其是所含有的多糖、黃酮，有很強的抗氧化活性，藥用價值較高。蕨菜含有的黃酮最主要的藥理作用是降血脂、抗氧化、清除自由基以及抗衰老，除此之外，還具有降血壓、抗突變、保護肝臟、抗動脈粥樣硬化、免疫調(diào)節(jié)、抗血栓、關節(jié)疼痛、脫肛、痢疾以及預防麻疹、流感等作用，近年來還發(fā)現(xiàn)蕨菜黃酮具有一定的抗宮頸癌和肝癌腫瘤作用[3]。

陜西省商洛市自古以來就有采食蕨菜的飲食文化[4]，傳說“商山四皓”因采食蕨菜而長壽。近年來商芝更是作為名菜銷往東南亞、日本以及韓國等地。正是由于商洛地區(qū)蕨菜資源豐富，具有良好的發(fā)展前景和藥用及食用價值，所以主要針對該地區(qū)蕨菜的抗氧化活性研究，以期為該地蕨菜資源的進一步綜合利用提供參考。

1材料與方法

1.1材料與試劑

新鮮商洛蕨菜購于商洛市集，并經(jīng)李筱玲藥師鑒定為鳳尾蕨科蕨屬，除掉雜質(zhì)淋洗，置60 ℃烘箱中干燥，粉碎，過40目篩，貯干燥器中備用。

試劑：無水乙醇（EtOH）、乙二胺四乙酸（EDTA）、磷酸二氫鉀（KH2PO4）、磷酸氫二鉀（K2HPO4）、磷酸二氫鈉（NaH2PO4）、鹽酸（HCl）、碳酸氫鈉（NaHCO3）、氫氧化鈉（NaOH）、亞硝酸鈉（NaNO2）、硝酸鋁[Al（NO3）3]、三氯化鐵（FeCl3）、雙氧水（H2O2）、鐵氰化鉀[K3Fe（CN）6]、三氯乙酸（TCA）、氮藍四唑（NBT）、1，1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）、還原型輔酶（NADH）、吩嗪甲硫酸鹽（PMS）、二丁基羥基甲苯（BHT）。試劑均為分析純，試驗用水為蒸餾水。

1.2主要試驗儀器與設備

HYP-150型粉碎機;SPX-250C型恒溫恒濕培養(yǎng)箱;超聲波提取器;RE-210D型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀;755B型紫外可見分光光度計;電熱恒溫水浴鍋;超速離心機。

1.3試驗方法

1.3.1蕨菜總黃酮的提取準確稱取蕨菜粉末 20 g，置于小燒杯中，加入120 mL 70%乙醇，溫度為 60 ℃，超聲提取3次，每次30 min[5]，濾去殘渣，加入活性炭進行脫色處理，按體積比為1 ∶1加入石油醚脫脂，棄去石油醚層，減壓濃縮至一定體積，干燥，得到蕨菜總黃酮。

1.3.2DPPH自由基清除能力測定分別取 1 mL 不同質(zhì)量濃度的蕨菜總黃酮樣品（1.2、1.6、2.0、2.4、2.8、3.2、3.6、4.0 mg/mL）放于標記好的試管中，然后依次加入3 mL 0.004% DPPH乙醇溶液，充分混勻，避光靜置20 min后[6-7]，以乙醇作空白對照，在517 nm波長處測吸光度（D1），以蒸餾水代替樣品液作陰性對照（D2），BHT作陽性對照。

清除率=（1-D1/D2）×100%。

1.3.3羥自由基清除能力測定利用Fenton體系法[8-10]測定，羥自由基在波長510 nm處有最大吸收峰，如果在反應體系中加入有清除·OH能力的物質(zhì)，與水楊酸競爭·OH，使有色物質(zhì)生成量減少。在510 nm波長處測定吸光度。分別取1 mL不同質(zhì)量濃度樣品（1.2、1.6、2.0、2.4、2.8、3.2、3.6、4.0 mg/mL）放于標記好的試管中，先后加入 1.50 mL 反應液（含0.1 mmol/L EDTA、0.1 mmol/L FeCl3和2.8 mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH值為7.4）、0.35 mL 20 mmol/L H2O2，加入2.00 mL 6 mmol/L 水楊酸，37 ℃恒溫水浴作用40 min后，終止反應，于532 nm波長處測定吸光度（D3），以蒸餾水為陰性對照（D4），BHT作為陽性對照。

清除率=（1-D3/D4）×100%。

1.3.4總還原力測定法分別取1 mL不同質(zhì)量濃度樣品（1.2、1.6、2.0、2.4、2.8、3.2、3.6、4.0 mg/mL）放于標記好的試管中，依次加入2.5 mL PBS（pH值為6.6）、2.5 mL 1% K3[Fe（CN）6]，混勻后于 50 ℃ 水浴中孵育20 min，再加2.5 mL 10% TCA終止反應，離心5 min，取上清2.5 mL，依次加入 2.5 mL 無水乙醇和0.5 mL 0.1% FeCl3[6-7，11]，混勻后于700 nm波長處測定吸光度，以蒸餾水為陰性對照，BHT為陽性對照。

1.3.5超氧陰離子清除能力測定法分別取1 mL不同質(zhì)量濃度樣品（1.2、1.6、2.0、2.4、2.8、3.2、3.6、4.0 mg/mL）放于標記好的試管中，依次加入 2 mL 0.078 mol/L NBT、2 mL 0.468 mmol/L NADH，最后加入0.8 mL 0.060 mol/L PMS溶液，室溫搖勻后，靜置10 min，離心5 min[6-7，12]，于560 nm波長處測定吸光度（D5），調(diào)零孔用不同質(zhì)量濃度樣品液2 mL、0.8 mL蒸餾水代替PMS溶液調(diào)零，用蒸餾水作陰性對照（D6），BHT作陽性對照。

清除率=（1-D5/D6）×100%。

2結(jié)果與分析

2.1蕨菜總黃酮對DPPH自由基的清除作用

由圖1可知，在一定濃度梯度范圍內(nèi)，蕨菜總黃酮和BHT對DPPH自由基的清除率都呈上升趨勢。在1.2～4.0 mg/mL的濃度范圍內(nèi)，蕨菜總黃酮對DPPH的清除能力弱于BHT，當濃度低于 2.8 mg/mL 時，蕨菜總黃酮對DPPH的清除能力迅速增加，但隨著濃度的遞增，BHT對DPPH的清除能力無明顯變化。當蕨菜總黃酮質(zhì)量濃度為 4.0 mg/mL 時，清除率為55.34%。

2.2蕨菜總黃酮對羥基自由基的清除能力

由圖2可知，蕨菜總黃酮與BHT相比，在試驗測試的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，其對羥基自由基的清除能力比BHT弱，可是蕨菜總黃酮對羥基自由基清除能力的增幅卻大于BHT。隨著蕨菜總黃酮濃度的增加，其清除率也同時增強，當蕨菜總黃酮質(zhì)量濃度為4.0 mg/mL時，清除率為71.30%，表明蕨菜總黃酮對羥基自由基具有較好的清除能力。

2.3蕨菜總黃酮總還原力的測定

由圖3可知，BHT的還原能力比蕨菜總黃酮的總還原力高。當蕨菜總黃酮質(zhì)量濃度達到 4.0 mg/mL 時，吸光度為0.735，這說明在試驗測試的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，蕨菜總黃酮具有較好的還原能力。

2.4蕨菜總黃酮對超氧陰離子的清除能力

由圖4可知，蕨菜總黃酮對超氧陰離子的清除作用與其濃度呈正相關關系，在同一質(zhì)量濃度下，蕨菜總黃酮對超氧陰離子的清除率低于BHT，在低濃度時，二者清除能力都迅速增加，達到2.0 mg/mL以后，BHT的超氧陰離子清除能力趨于平穩(wěn)，而蕨菜總黃酮的清除能力仍在增加，在4.0 mg/mL以后，清除力不再增加。這說明在蕨菜總黃酮試驗濃度范圍內(nèi)，蕨菜總黃酮具有較強的清除超氧陰離子的作用。

3結(jié)論與討論

通過對商洛地區(qū)蕨菜總黃酮的研究發(fā)現(xiàn)，商洛蕨菜總黃酮對DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子都具有較好的清除能力，說明商洛蕨菜總黃酮具有一定的抗氧化、清除自由基、抗衰老作用。

研究中還發(fā)現(xiàn)，在試驗質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，蕨菜總黃酮樣品溶液質(zhì)量濃度較小時，其與BHT的清除能力相差較大，但蕨菜總黃酮對自由基的清除率增幅大于BHT。當質(zhì)量濃度為 4.0 mg/mL 時，蕨菜總黃酮對DPPH自由基的清除率可達到55.34%，對超氧陰離子自由基的清除率達到81.00%，表明商洛蕨菜總黃酮的部分抗氧化能力趨近于BHT，可以作為一種天然抗氧化劑來利用。

陳燕芹等研究蕨菜總黃酮在4.0 mg/mL時對DPPH自由基的清除率為38%[13]，本研究結(jié)果表明，商洛蕨菜總黃酮在2.4 mg/mL時對DPPH自由基的清除率就已達到38%，當濃度大于2.8 mg/mL時，清除率增幅變緩。蔡麗等研究表明，黃酮濃度在0.56 mg/mL時就已達到羥基自由基最大清除率，而在1.20 mg/mL之后略有減小[14]，本研究中，總黃酮濃度在1.2 mg/mL時對羥基的清除率僅為10%，此后清除率隨濃度增加而增加，當達到 3.2 mg/mL 以后，清除率增幅逐漸減緩，趨于平穩(wěn)。陳乃東等研究的蕨菜總提物和本試驗所測蕨菜總黃酮在1.2 mg/mL時對超氧陰離子的清除率基本相近;在2.4 mg/mL時，陳乃東等研究表明清除率已達到73%[15]。而本研究結(jié)果僅為59%，但在試驗濃度范圍內(nèi)清除率一直呈增加趨勢，在 4.0 mg/mL 時，已達到81.00%。這可能與不同產(chǎn)地蕨菜中總黃酮含量及分離純化方法不同有關。

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