金訶牌雪益康膠囊急性毒性和遺傳毒性試驗研究

劉有菊 馬文俊 袁發榮 孫躍寧 陳海蓮

摘要：目的：研究金訶牌雪益康膠囊的急性毒性和遺傳毒性實驗，評價其食用安全性。方法：依據《食品安全性毒理學評價程序和方法》進行急性毒性試驗、遺傳毒性試驗（Ames 試驗、骨髓細胞微核試驗和精子畸形試驗）。結果：小鼠急性毒性試驗經口最大耐受劑量（MTD）>30 g/kg·bw，屬無毒級。Ames 實驗、骨髓細胞微核試驗和精子畸形試驗結果均為陰性，表明受試物無致突變作用。結論：金訶牌雪益康膠囊急性毒理分級屬無毒級，無遺傳毒性，在本試驗劑量范圍內，金訶牌雪益康膠囊屬于安全性保健食品。

關鍵詞：金訶牌雪益康膠囊；急性毒性；遺傳毒性；

金訶牌雪益康膠囊產品配方精選海拔3000米左右高原特色草本植物唐古特白刺果、柴達木枸杞果、沙棘果等為主要原料制成的保健食品。優越的地理環境，日照時間長，太陽輻射強，晝夜溫差大，培育出高活性的高原物質。以傳統醫學與現代養生理論為指導原則，六種植物科學配伍、合理配比，采用傳統炮制與現代工藝相結合的技術手段，精制而成的一款高端產品，其主要保健功能是調節血糖。

為評價產品的安全性，根據《保健食品檢驗與評價技術規范》的要求，現進行金訶牌雪益康膠囊的急性毒性及遺傳毒性試驗。

1. 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 受試樣品 金訶牌雪益康膠囊由金訶藏藥股份有限公司提供。樣品推薦量為每日3次，每次3-4粒，0.3g/粒，總量為3.6g，相當于成人推薦量0.06g/kg·bw（以60kg計）。

1.1.2 實驗動物和飼養環境 KM種小鼠，清潔級，體重18-22g，動物合格證號：青醫動字第001號，由青海省實驗動物中心提供；實驗動物購進后首先于恒溫恒濕的動物房環境中適應3天，單籠飼養。

1.1.3 菌株 鼠傷寒沙門氏菌TA97a、TA98、TA100 、TA102。由上海市疾病預防控制中心提供。

1.1.4 主要儀器 超凈工作臺、電子天平、壓力蒸汽滅菌器、HH-6數顯恒溫水浴鍋（常州澳華儀器有限公司）、培養箱、恒溫電熱鼓風干燥箱。

1.2 方法

1.2.1 急性毒性試驗

按最大耐受量試驗方法進行，取健康KM種小鼠40只，體重18-22g/只，雌雄各半。于正式試驗前晚禁食不禁水16h，次日，用經過三次預試后確定的30g/kg劑量，經口灌胃給藥后，觀察兩周，記錄小鼠中毒表現、死亡情況。

1.2.2 Ames試驗

試驗按照平板摻入法，經鑒定符合要求的鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型TA97、TA98、TA100、TA102四株菌株進行試驗；受試樣品設5個劑量組：8、40、200、1000、5000ug/皿，同時設立自發回變組、溶劑對照組和陽性對照組。按《保健食品檢驗與評價技術規范》（2003 年版）中鼠傷寒沙門氏菌/哺乳動物微粒體酶試驗中平板摻入法，在保溫的45℃ 2mL 頂層培養基中，依次加入0.1mL受試物、0.1mL 菌株增菌液，需活化時加入 0.5mL S9混合液，充分混勻迅速傾倒底層平板，做3個平行平板。37℃培養 48h，計數回變菌落數，試驗重復一次。如果受試物的回變菌落數增加超過自發回變菌落數的2倍以上，并具有劑量反應關系者，即為誘變試驗陽性。

1.2.3 小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗

健康KM種小鼠50只，體重25-30g/只，隨機分為5組，雌雄各半，10只/組。根據急性毒性實驗LD50值，設3個受試物組（1/2 LD50、1/4 LD50、1/8 LD50）即15.00、7.50、3.75g/（kg·BW）3 個樣品劑量組，分別稱取金訶牌雪益康膠囊15.00、7.50、3.75g，加蒸餾水20ml溶解待用，另設40mg/（kg·BW）環磷酰胺為陽性對照組、離子水陰性對照組；給藥后各組均間隔24h灌胃0.20ml/10g體重，于末次灌胃給藥后6h脫頸椎處死，取雙側股骨，滴加1滴小牛血清，制成細胞懸液，涂片制片，油鏡下選擇細胞分散好、形態完整、染色良好部位，按一定順序進行計數。計數嗜多染紅細胞（PCE）及帶微核的細胞（MNPCE）共1000個，每只小鼠計數微核的千分率。

1.2.4 小鼠精子畸形試驗

選25-30g/只健康KM種雄性小鼠50只，隨機分為5組，每組10只，給藥組按1/2 LD50、1/4 LD50、1/8 LD50，40mg/ kg·bw環磷酰胺陽性對照組、陰性對照組（離子水），各組雄性小鼠按照相應的劑量，分別連續灌胃5d后，喂養觀察30d。于第35d處死小鼠，取兩側副睪的精子涂片精子，按規定涂片制成。觀察計數各組小鼠完整精子1000個，計算精畸率。

1.3 統計學處理

2. 結果

2.1 金訶牌雪益康膠囊對小鼠急性毒性試驗的結果

經觀察兩周，雌雄兩組動物均未發現中毒癥狀、異常反應，生長良好，觀察期未見死亡。于實驗末，安樂法處死動物，大體解剖肉眼觀察各臟器情況，未見異常。金訶牌雪益康膠囊對小鼠急性毒性試驗LD50>30g/ kg·bw。根據急性毒性分級標準，屬無毒級。見表1：

2.2 金訶牌雪益康膠囊Ames試驗結果

由表2、表3可見，經兩次Ames實驗，5個劑量組回變菌落數與自發回變菌落數相比較，四種菌株在加與不加S-9的條件下，均無顯著性差異；而陽性對照回變菌落數高于陰性對照組回變菌落數的2倍以上。表明紅珍珠牌“雪之健”膠囊無致突變作用。

2.3 小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗

由表4可見，金訶牌雪益康膠囊高、中、低劑量組與空白對照組比較，微核千分率均無統計學意義（P>0.05），而環磷酰胺組微核率則顯著高于空白對照組，有統計學意義（P<0.01）。表明金訶牌雪益康膠囊對小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核率未見明顯影響，檢測結果為陰性。

2.4 小鼠精子畸形試驗

由表5可見，紅珍珠牌雪之健各劑量組小鼠精子畸形率與空白組比較，小鼠精子畸形率無顯著性差異（P>0.05），而環磷酰胺組與空白組比較，小鼠精子畸形率明顯升高，差異有統計學意義（P<0.01）。

3. 討論

高血糖是指患者血中糖的含量長期持續超過正常水平，它的判斷標準主要為血糖值。短時間內一次性的高血糖對人體無嚴重損害，而長期的高血糖會使全身各個組織器官發生病變，其主要原因歸咎于糖尿病慢性并發癥。現已確認慢性并發癥與長期代謝控制不佳有關。對其發生機制的解釋是由于胰島素不足所致細胞內糖、脂、蛋白質代謝紊亂。大量臨床動物研究結果表明：在一些易致糖尿病并發癥的組織如神經、腎、視網膜、晶體中，葡萄糖的攝取、利用并不依賴胰島素，細胞內的葡萄糖濃度與體液內一樣高。長期血糖過高能直接損害這些組織。

金訶牌雪益康膠囊配方原料-白刺果生長在青海柴達木盆地，古稱“唐古特”產區的白刺果為蒺藜科白刺屬灌木。成熟的白刺果實晶瑩剔透，紅的像珍珠，紫的似瑪瑙，人們親切地稱之為“高原紅珍珠”。據《本草綱目》記載的白刺，療丈夫虛損，陽痿精自出，補腎氣，益精髓。《藏醫精髓與醫學寶典》“白刺果可入藥，健脾胃、滋補強身、舒經活血，主治肺病和胃病，果核可榨油。” 富含總黃酮、氨基酸、生物堿、脂肪酸、維生素、多種礦物質及微量元素。研究表明，唐古特白刺果實對多種高血糖動物模型具有較好的降血糖作用。枸杞含有枸杞多糖、類胡蘿卜素、甜菜堿、維生素、微量元素等人體所必需的營養成分。枸杞水提取物可明顯降低正常小鼠的血糖，對腎上腺素、四氧嘧啶所致（模型）小鼠高血糖亦具有明顯抑制作用，且有量效關系。被世界植物群體中公認的Vc之王，因其果實含有人體不能合成的多種維生素，故有“天然維生素寶庫”之稱的沙棘，富含維生素、黃酮類及多酚類、不飽和脂肪酸、植物甾醇類及植物固醇、微量元素等；沙棘果中黃酮能體外清除自由基及抗脂質過氧化，對正常小鼠的血糖具一定的降低作用。麥芽為禾本科植物大麥的成熟果實經發芽干燥的炮制加工品。麥芽含淀粉酶、轉化糖酶、維生素B、脂肪、磷脂、糊精、麥芽糖、葡萄糖等；大劑量麥芽可調整血糖、血脂水平，明顯降低血漿游離脂肪酸，升高血清瘦素水平。山楂含有黃酮類、有機酸、磷脂、維生素等。山楂總黃酮可通過抑制腎組織TGF-β1和CTGF的過度表達，從而對2型糖尿病腎病具有保護作用。山藥含有薯蕷皂苷元、山藥多糖、山藥堿、氧化酶、糖蛋白、多種甾醇類物質等。山藥多糖能降低四氧嘧啶所致大鼠的血糖水平，其降糖作用隨著給藥劑量的增加而增加。 研究表明，金訶牌雪益康膠囊能明顯降低四氧嘧啶所引起的高血糖模型大鼠的空腹血糖水平。

作者簡介：

劉有菊（1987-），研究實習員，主要從事藏藥新藥及保健食品的研究開發。

基金項目：

藏藥新藥開發國家重點實驗室（NO.2015DQ870717）；青海省藏藥新藥開發重點實驗室（NO.2017-ZJ-Y15）