甜葉菊葉斑病病原真菌的分離及分子生物學鑒定

崔曉霞 束紅梅 倪萬潮 何曉蘭 鞏元勇 郭書巧

摘要：為明確引起甜葉菊葉斑病的病原菌種類，2018年7月從江蘇省東臺市富安鎮甜葉菊生產基地采集病樣。采用組織分離法，獲得4種病原真菌分離物，觀察分離物的菌落形態及分生孢子形態特征并進行致病性測定，利用MEGA 7軟件的鄰接法（neighbor-joining，簡稱NJ）基于病原菌的rDNA-ITS、GAPDH、CHS-1區序列和GenBank中相關病原菌的相應序列構建系統進化樹，確定病原菌的種類。因此，江蘇省東臺市富安鎮甜葉菊生產基地甜葉菊葉斑病的致病菌鑒定結果為炭疽菌和鏈格孢菌。目前為止，我國關于甜葉菊病害病原物鑒定方面的報道還很少，本研究首次報道并分離鑒定由炭疽菌引起的甜葉菊葉斑病。

關鍵詞：甜葉菊[Stevia rebaudiana （Bertoni）];葉斑病;病原菌鑒定;炭疽菌;鏈格孢菌

中圖分類號： S432.4+4? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）14-0117-08

甜葉菊[Stevia rebaudiana （Bertoni）]屬菊科斯臺維亞屬多年生草本植物。甜葉菊葉片富含甜菊糖苷類、黃酮類、酚類及衍生物、揮發油類等化學成分[1]。黃酮類化合物具有抗腫瘤、抗自由基和抗氧化等多種藥理活性;甜菊糖苷（steviol glycosides，簡稱SGs）則是一類新型的天然甜味劑，具有高甜度、低熱量、安全無毒等特點[2]，逐漸成為食品和醫藥領域研究開發的熱點[3-4]。2018年筆者在江蘇省東臺市富安鎮的甜葉菊生產基地發現了發病的甜葉菊植株，葉片上呈現出大小不等的近圓形病斑，一些發病比較嚴重的植株葉片枯萎、整株死亡，到后期嚴重影響到甜葉菊的經濟產量。因此，分離并鑒定引起甜葉菊葉斑病的病原菌種類，對于該病害的防治具有重要意義。

炭疽菌屬（Colletotrichum spp.）真菌分布廣泛，寄主繁多，尤其在熱帶和亞熱帶農作物以及果樹上[5]，可以引起大量經濟作物的炭疽病，比如玉米、豆類、草莓、咖啡、辣椒、葫蘆、土豆等[6-11];常危害植物葉、花、果、莖及嫩枝，引發各種農作物的炭疽病，影響植物的生長發育，降低作物品質，嚴重時可造成落花、落果，甚至植株死亡，導致農作物減產，如柿子炭疽菌（C. horii）主要侵染果實和樹枝，引起頂梢枯死，嚴重的甚至整樹枯死[12];也可危害采后果實，常造成果實腐爛，影響產品質量，導致嚴重的經濟損失。準確鑒定炭疽菌有助于對炭疽病的有效防控。由于炭疽菌的種間形態特征差異小、比較接近，若僅以形態學特征對其進行鑒定是不夠準確的，分子系統學作為近年來快速發展起來的一種方法，為炭疽菌的準確分類提供了有力依據[13-15]。在病原真菌的鑒定中應用最為廣泛的是核糖體內轉錄間隔區的rDNA-ITS序列，該DNA序列也是最先被應用于炭疽菌分類的[16]。由于許多炭疽菌是復合種群，并且種間菌株間變異大，有多個專化型或生理小種，因此，ITS序列不能有效地區分炭疽菌復合種群的近緣種[17-18]。近年來，越來越多的研究報道傾向于利用多個基因序列來開展炭疽菌的鑒定和遺傳多樣性分析[19]。本研究利用內轉錄間隔區（internal transcribed spacer，簡稱ITS）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，簡稱GAPDH）和幾丁質合酶（chitin synthase，簡稱CHS-1）基因的部分序列對分離自甜葉菊的炭疽菌進行鑒定，明確引起甜葉菊葉斑病的病原菌種類。

鏈格孢菌（Alternaria spp.）是自然界中廣泛存在、危害嚴重的一種死體營養型植物病原真菌[20]。鏈格孢菌可引起多種植物特別是農作物，如小麥、玉米、蘋果、梨等幾十種農作物的真菌性病害，造成嚴重的經濟損失[21]。在美國伊利諾斯州，曾因細極鏈格孢（A. tenuissima）引起大豆猝倒病，造成15%的產量損失[22]。我國各地廣泛發生的番茄、馬鈴薯等茄科蔬菜的早疫病，則是由A. solani為主的病原真菌引起的[23-24]。1982年，日本首次發現1種鏈格孢屬真菌A. steviae能引起甜葉菊黑斑病[25]，病斑呈黑色不規則形狀擴展，周圍區域呈褪綠狀態。印度和伊朗也分別于2007、2015年首次分離鑒定到鏈格孢屬真菌為引起甜葉菊葉斑病的致病病原菌[26-27]。2018年崔曉霞等從發病甜葉菊葉片中分離鑒定到引起褐斑病的鏈格孢菌[28]。本研究利用形態學與分子生物學手段鑒定到引起甜葉菊葉斑病的致病病原菌鏈格孢菌，為深入開展該病害的發生發展規律、綜合防治以及抗病育種研究提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 葉斑病標樣采集及病原菌分離

2018年7月從江蘇省東臺市富安鎮甜葉菊生產基地采集葉片帶有病斑的甜葉菊譜星1號病株，于江蘇省農業科學院經濟作物研究所完成試驗部分。剪取病健交接處大小為0.5 cm×0.5 cm的葉片，首先用無菌水沖洗3～5次，用70%乙醇表面消毒30 s，再用0.1% HgCl2處理2 min，最后用無菌水漂洗3～5次，用無菌濾紙除去葉片表面水分，將材料平鋪于添加有鏈霉素（40 μg/mL）的PDA平板培養基上，于黑暗條件下25 ℃培養3～5 d，從新長出的菌落邊緣挑取少量菌絲接種到新的PDA平板上進一步分離純化，記錄菌落的形態學特征。

1.2 病原菌的致病性測定

選擇健康無病、無傷痕的甜葉菊葉片，在實驗室進行離體葉片接種試驗，進行分離菌株的致病性檢測。每個菌株均為3次重復試驗。將葉片用70%乙醇進行表面消毒后再用無菌水清洗，置于鋪有保濕濾紙的培養皿內。將上述分離純化的菌株在新的PDA平板上培養7 d，采用菌絲塊接種法，用滅菌刀沿菌落邊緣切取3 mm×3 mm大小的菌餅，菌絲面朝下、避開主葉脈貼于已消毒處理的甜葉菊葉片背面兩側，同時接種空白的PDA培養基塊作為對照。接種后做好保濕，置于25 ℃條件下誘導發病，每天觀察并記錄發病情況;待接種后的甜葉菊葉片發病后，將病原菌重新進行分離純化，觀察新分離物與接種菌是否相同。

1.3 病原菌分生孢子形態學觀察

將分離得到的致病菌株接種到新的PDA培養基上，置于28 ℃培養箱中黑暗培養8 d。取PX-2菌落上橘色的分生孢子團溶于適量的無菌水中;PX-3 和PX-4則從菌落邊緣表面切取小塊薄的、帶菌絲的培養基，將其放置到載玻片上，在光學顯微鏡（Olympus CX41，Japan）下觀察分生孢子及分生孢子梗的形態并拍照，用目鏡測微尺測量分生孢子的大小。結合病原菌菌落在PDA培養基上的形態特征及色澤特征，參考《真菌鑒定手冊》[29]確定病原菌的種類。

1.4 病原菌的分子生物學鑒定

1.4.1 總DNA的提取

將分離得到的菌株接種到PDA培養基上，置于28 ℃培養箱中培養10 d，從培養基表面刮取菌絲，加入液氮迅速研磨成粉末，參照真菌基因組DNA提取試劑盒（Solarbio，China）操作說明提取菌株DNA，并將DNA樣品放于-20 ℃保存備用。

1.4.2 ITS、GAPDH、CHS-1區擴增

采用真菌核糖體基因轉錄間隔區的通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）、3-磷酸甘油醛脫氫酶基因GAPDH區通用引物：GDF：5′-GCCGTCAACGACCCCTTCATTGA-3′和GDR：5′-GGGTGGAGTCGTACTTGAGCATGT-3′、幾丁質合成酶基因CHS-1區通用引物：CHS-79F：5′-TGGGGCAAGGATGCTTGGAAGAAG-3′和CHS-345R：5′-TGGAAGAACCATCTGTGAGAGTTG-3′對病原菌的基因組DNA進行PCR擴增。PCR反應體系50 μL：2 μL DNA模板、各1 μL上下游引物、5 μL 10×PCR buffer（Mg2+ plus）、4 μL dNTP Mix（2.5 mmol）、1 μL rTaq DNA聚合酶，無菌ddH2O補齊至50 μL。PCR擴增程序如下：94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共33個循環;最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.4.3 PCR產物切膠回收與克隆

取“1.4.2”節中的PCR擴增產物加入6×DNA loading buffer混勻，于1%瓊脂糖凝膠上檢測樣品條帶大小是否正確并特異。檢測正確的PCR產物使用DNA凝膠回收試劑盒（Axygen，USA）回收純化，將其與 pEASY-T1 克隆載體（TransGen，China）連接，連接產物轉入大腸桿菌Trans1-T1感受態細胞（TransGen，China）中，經菌落PCR鑒定后，選取陽性克隆送上海英駿生物技術有限公司進行測序。

1.4.4 病原菌的ITS、GAPDH、CHS-1序列分析

將測得的ITS、GAPDH、CHS-1區序列在GenBank中進行同源性搜索，分別與已報道真菌菌株的ITS、GAPDH、CHS-1區序列進行同源性比較。利用MEGA 7軟件的鄰接法（neighbor-joining，簡稱NJ）構建系統發育樹。將比較結果與病原菌的形態特征、培養性狀和致病性結合起來，對病原菌進行鑒定。

2 結果與分析

2.1 病原菌的分離純化

在江蘇省東臺市富安鎮甜葉菊生產基地采集甜葉菊譜星1號病樣，對分離菌株的菌落形態和分生孢子形態進行觀察，結果分離到4種病原菌，將分離菌株編號為PX-1、PX-2、PX-3、PX-4。

2.2 病原菌的培養特性和形態學特征

4個分離菌株在PDA培養基上呈近圓形等徑輻射生長，氣生菌絲初期為白色（圖1）。PX-1菌株在生長后期菌落中心出現淡粉色，由菌落中心向菌落四周輻射生長（可能由于培養條件或其他因素，未能成功培養到分生孢子，將在后續研究中進一步優化培養條件或利用一些外界條件刺激誘導分生孢子的產生）。PX-2菌絲排列整齊，毛絨狀，培養7 d后，菌落表面產生橘紅色分生孢子團，分生孢子長橢圓形，表面光滑，無色，單胞，圓柱形或橢圓形，多數兩端鈍圓，大小為（15.0～226） μm×（4.0～6.5） μm（圖2-A）。PX-3和PX-4氣生菌絲較為發達，生長后期逐漸變為不同程度的灰黑色，基質呈現不同類型的同心輪紋，在PDA平板上培養8 d的菌落產生大量的分生孢子，顯微鏡下觀察，分生孢子單生或成鏈，形態多樣，多為近球形、倒棒狀或倒梨形，大小為（19.7～47.6） μm×（6.7～15.8） μm（圖2-B、圖2-C）。根據這些形態學特征，參照魏景超的《真菌鑒定手冊》[29]及張天宇的《中國真菌志》[19]初步判斷PX-1和PX-2為炭疽菌、PX-3和PX-4為鏈格孢屬霉菌。

2.3 病原菌致病性測定

采用離體葉片接種方法，對葉片發病情況進行觀察統計。由圖3可知，4個分離的菌株對甜葉菊葉片致病程度存在一定的差異，PX-1和PX-2菌株侵染葉片后病斑擴展速度快，在接種后72 h發病部位出現水漬狀淺褐色病斑;PX-3侵染后發病程度相對較輕，發病位置呈黑褐色;而PX-4在接種后的第7天病斑仍局限于葉片的創傷位點。因此，引起甜葉菊葉片葉斑病的PX-1和PX-2菌株的致病力較強，PX-3對甜葉菊的致病力則相對較弱，而PX-4菌株的致病力則相對最弱。從接種發病的葉片病斑上刮取少量的病組織鏡檢，可觀察到與接種菌株一致的菌絲和分生孢子。對發病組織進行病原菌的再分離， 同樣獲得與接種病原真菌菌落形態一致的培養物，完成柯赫氏法則（Koch postulates）致病性檢測。因此，接種所用的菌株是引起甜葉菊葉斑病的病原菌。

2.4 病原菌的分子鑒定

2.4.1 菌株PX-1和PX-2的分子鑒定

以菌株PX-1和PX-2的基因組DNA為模板，利用真菌rDNA-ITS區通用引物ITS1和ITS4分別擴增得到616、613 bp大小的ITS序列;利用GAPDH區通用引物GDF和GDR分別擴增得到252、280 bp大小的GAPDH序列;利用CHS-1區通用引物CHS-79F和CHS-345R分別擴增得到299、299 bp大小的CHS-1序列（圖4）。PCR產物測序結果表明，PX-1 和PX-2菌株間的rDNA-ITS、GAPDH、CHS-1序列之間存在差異。將序列在NCBI GenBank中進行同源性搜索，PX-1和PX-2與炭疽菌屬（Colletotrichum）真菌具有高度同源性，因此將分離到的真菌歸屬于炭疽菌。

利用rDNA-ITS區序列構建系統發育樹，PX-1 菌株與MG600754、KP743027等（Colletotrichum sojae和Colletotrichum gloeosporioides）聚為一類;PX-2 菌株則與MH863841和MF540883等（Colletotrichum gloeosporioides和Colletotrichum fructicola）相似度較高，聚為一類（圖5）。在此基礎上利用GAPDH和CHS-1區序列構建系統進化樹，發現PX-1菌株與MG600865等（Colletotrichum sojae）的序列相似度達到100%，PX-2菌株與MF540891及MG657351等（Colletotrichum fructicola）的序列相似度達到100%（圖6、圖7）。結合形態學觀察，進一步確認引起甜葉菊葉斑病的病原菌PX-1和PX-2為大豆炭疽菌（Colletotrichum sojae）和果生炭疽菌（Colletotrichum fructicola）。

2.4.2 菌株PX-3和PX-4的分子鑒定

以菌株PX-3和PX-4的基因組DNA為模板，利用真菌rDNA-ITS區通用引物ITS1和ITS4分別擴增得到571、572 bp 大小的ITS序列（圖8）， PCR產物測序結果表明，PX-3和PX-4菌株間的rDNA-ITS序列之間存在微小的差異。將序列在[KG*5]NCBI[KG*3]GenBank中進行同源性搜索，PX-3、PX-4與鏈格孢菌屬（Alternaria）真菌具有高度同源性，因此將分離到的真菌歸屬于鏈格孢菌。利用rDNA-ITS區序列構建系統進化樹，PX-3和PX-4菌株與KY814632.1和KY075667.1等（Alternaria alternata）聚為一類（圖9）。結合形態學觀察，進一步確認引起甜葉菊葉斑病的病原菌PX-3和PX-4為鏈格孢菌（Alternaria alternata）。

3 討論與結論

甜葉菊提取物甜菊糖苷作為甜味食品添加劑在南美已使用了數個世紀[30]，歐盟和美國也已開始批準使用[31]。甜菊糖苷同時具有一定的藥用價值[32]，例如對降血壓、增強胰島β細胞功能治療2型糖尿病以及清除人體自由基等功能[31，33-34]。我國的甜葉菊自20世紀70年代南京中山植物園從日本引入試種成功后，80年代初向全國各地推廣種植[35]。目前，我國關于甜葉菊病害已有相關報道。2008年，盧清會闡述了甜葉菊的病害有白絹病、立枯病、葉斑病和花葉病毒病，并提出了相應的防治方法[36]。近年來，甘肅河西走廊地區甜葉菊育苗期的病害呈逐年加重趨勢，猝倒病、立枯病和葉斑病成為育苗期最容易發生的3大病害，造成嚴重的經濟損失[37]。2017年，筆者在江蘇省東臺市富安鎮甜葉菊生產基地調查發現甜葉菊葉片上呈現不同程度的病斑，發病嚴重的植株葉片全部枯萎。經病原菌的分離、培養、純化，共分離得到4株病原真菌，為炭疽菌屬和鏈格孢屬真菌。致病性測定結果發現，炭疽菌PX-1和PX-2的對甜葉菊葉片的致病力最強，鏈格孢菌PX-3相對次之，鏈格孢菌PX-4的致病力則相對最弱。在下一步的研究中，將在試驗圃對這幾種病原菌進行混合組合接種，篩選高效的抑菌藥劑。

近年來，隨著分子生物學的發展，分子生物學技術在真菌的研究中也得到了廣泛應用。rDNA序列由于不同區域進化速度不同，因此可用于不同分類水平的研究[38]。特別是rDNA的ITS區段既具保守性，又在科、屬、種水平上均有特異性序列，通過對ITS區進行測序來診斷和檢測植物病原菌，尤其是對植物病原真菌的分子檢測已越來越被廣泛應用[39]。許鳳仙等在對中華常春藤黑腐病病原菌分離鑒定研究中采用了形態學特征觀察的方法，并結合柯赫氏法則和rDNA-ITS序列分析進行了驗證，明確引起中華常春藤黑腐病的病原菌為葡萄座腔菌[40]。2018年崔曉霞等利用病原菌形態學觀察結合rDNA-ITS序列分子生物學分析的方法，從甜葉菊守田3號品種中分離鑒定了引起甜葉菊褐斑病的病原菌為鏈格孢和細極鏈格孢菌[29]。ITS序列為多數物種的鑒定提供了有力工具，但對炭疽菌屬真菌系統發育樹構建的支持率較低，具有一定的局限性[41-42]。多基因涵蓋的信息比單基因多，系統發育分析能更準確地鑒定炭疽菌的種類[18]。李沛利等通過構建多基因（ITS、ACT、GAPDH、CHS-1、TUB2、CAL）系統發育樹鑒定出四川省鵝掌柴炭疽病的致病病原菌為暹羅炭疽菌（Colletotrichum siamense）[43]。為鑒定貴州省油茶炭疽病的病原菌種類，帥小春等采用ITS-CAL-GAPDH-ACT-TUB等5個基因序列構建系統發育樹，結合形態學特征鑒定，明確貴州省油茶炭疽病的病原菌種類[44]。

在本研究中，對引起甜葉菊譜星1號葉斑病的病原菌進行了分離鑒定，采用柯赫氏法則進行驗證，利用ITS、GAPDH和CHS-1基因序列構建系統發育進化樹，結合菌落形態和分生孢子形態特征，鑒定到引起甜葉菊葉斑病的2株炭疽菌：大豆炭疽菌（Colletotrichum sojae）和果生炭疽菌（Colletotrichum fructicola）;利用rDNA-ITS序列分子生物學分析結合形態學觀察的方法同時也鑒定到2株鏈格孢菌（Alternaria alternata）也可以引起甜葉菊葉斑病。本研究利用分子生物學手段結合形態學觀察的方法對引起甜葉菊葉斑病的病原菌進行鑒定，為該病的診斷和防治提供理論依據。

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收稿日期：2019-09-02

基金項目：江蘇省博士后科研資助計劃（編號：2018K224C）;江蘇省科技計劃（編號：SZ-SQ2017019）。

作者簡介：崔曉霞（1989—），女，甘肅定西人，博士，助理研究員，從事大豆抗病育種以及甜葉菊田間病害鑒定等方面的研究。E-mail：cuixiaoxia7@163.com。

通信作者：郭書巧，博士，副研究員，從事特色經濟作物的代謝調控研究。Tel：（025）84390290，E-mail：gsq925@163.com。