聲波處理增強擬南芥的抗病性

艾干 鄭芷若 張小藝 朱海 李田麗 夏慶月 竇道龍 景茂峰

摘要：近期研究發現，聲波可以激發植物的防衛反應，提高植物抗病性。然而，植物感知聲波誘導抗病的分子機制還缺乏深入研究。選定特定頻率和振幅的聲波處理擬南芥，考察擬南芥與病原細菌丁香假單胞菌互作的影響。結果表明，聲波預處理后植株葉片中的細菌生長量相比于對照組降低87.5%。利用轉錄組分析結果表明，擬南芥共有317個基因發生差異表達，其中有232個上調表達基因，85個下調表達基因，并且這些上調表達基因主要富集于防衛反應相關基因。實時定量PCR結果顯示，2個防衛反應關鍵基因PR1和FRK1顯著上調表達，說明聲波處理可以通過激活擬南芥的基礎防衛反應，增強植物對丁香假單胞菌的抗性。最后，利用MEME軟件分析聲波處理后上調表達的基因的保守轉錄元件，鑒定了 “AAXXAGAGAG”等3個特異性響應聲波的轉錄元件。研究結果綜合表明聲波處理可以明顯提高植物的抗性，這為把聲波用于作物病害控制奠定了理論基礎。

關鍵詞：聲波;植物抗病;擬南芥;丁香假單胞;防衛反應

中圖分類號： S432.2? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）14-0125-06

植物沒有動物類似的神經系統和運動器官，卻須要適應復雜而多變的環境，因此在漫長的進化過程中，植物進化出多種復雜的機制感受周圍環境的變化以調節自身生長發育。聲波作為環境中的一種機械刺激，可以引起植物的多種復雜反應，包括觸摸形態學建成[1]、開花、衰老、葉綠素含量、激素水平、氣孔開閉以及生物和非生物脅迫抗性水平等[2]。有證據顯示植物對自然聲音有響應，比如，植物在處于蜜蜂產生特定頻率的嗡嗡聲中時會從花藥中釋放出花粉，這種行為被稱作振動傳粉[3]。通過“綠色音樂”（如鳥類和蟋蟀的“歌唱”等聲音）處理后，大白菜中多胺和氧氣吸收量的增加也證實了這一特性[4]。此外，還有證據表明植物可以選擇性地響應特定頻率的聲波，例如菜青蟲咀嚼聲引起的振動可以誘導擬南芥的化學防御。然而，在同一研究中，葉蟬發出的聲波卻未能引發防御反應[5]。在 1 400 Hz 聲波處理下，菊花顯示出吲哚-3-乙酸的積累和脫落酸含量減少[6]。玉米幼根生長于特定聲音頻率（220 Hz）下，表現出趨音性[7]。上述研究表明植物已進化出了對聲波的響應機制，有假說認為細胞骨架-質膜-細胞壁界面在聲波感知中發揮了重要作用[4]。

在對水稻、小麥和番茄等作物的研究中，發現聲波可以刺激種子萌發，增加果實數量，增長作物株高，增多作物分蘗數和提高作物產量[8]。聲波的預處理甚至可以緩解水稻面臨的干旱脅迫[9]。1 000 Hz 的聲波處理會提高菊花、石斛和獼猴桃的品質[8]。有研究表明，擬南芥可以通過感知昆蟲食草時產生的聲波，從而引發系統化學防御[5];聲波還可以誘導草莓的抗病性[10]，增強擬南芥對灰霉菌的抗性[10-11]。聲波是一種無污染、耗能少、適用性高的物理手段。依托聲波處理的病害防控和生長調控技術可能是未來增加作物抗病性的一種簡單且經濟的方法，了解聲波介導抗性的機制將能更好地指導農業生產。為了探索聲波是否能誘導植物對半活體病原菌的抗性，并解析聲波誘導植物抗性的機制，本研究以模式植物擬南芥和半活體模式病原菌丁香假單胞菌作為研究對象，研究聲波處理對擬南芥抗丁香假單胞菌能力和基因表達的影響。由于植物響應聲波的特異性，還對聲波誘導后上調的基因進行保守轉錄元件的預測，鑒定3個特異性響應聲波的轉錄元件。

1 材料與方法

1.1 供試菌株和植物材料

本研究中使用的植物材料擬南芥生長環境為22 ℃，10 h光照、14 h黑暗的人工氣候室。

所用接種菌株為丁香假單胞菌菌株（Pst）DC3000，于含有相應抗性的KB培養液（蛋白胨 20 g，甘油10 mL，K2HPO4 15 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，加水定容至10.0 mL）中搖菌后保存成20%的甘油菌于-70 ℃冷凍保存。丁香假單胞菌于 28 ℃ 培養箱中培養，由筆者所在實驗室保存。

1.2 聲波處理

參考前人研究結果[3，6]，選擇500 Hz、100 dB作為聲波處理的頻率和振幅。將生長30 d的擬南芥植株分別放入2個條件一樣的光照培養箱中，在處理組的培養箱中放入一個音箱，持續播放電腦生成的500 Hz聲波，并結合分貝儀將音量調整至 100 dB。對照組的培養箱不作處理。聲波處理 30 min 后進行接種或轉錄組測序（RNA-seq）。

1.3 丁香假單胞菌接種分析

首先取Pst相應菌株，重新活化后挑取單克隆接種于KB液體培養基中，28 ℃過夜培養。4 000 r/min 離心5 min收集菌體。再用滅菌的去離子水懸起菌體洗滌3次。調整菌體濃度為 106 CFU/mL。然后選擇聲波處理過的和未處理的擬南芥植株，用去針頭的1 mL注射器從葉片背面將菌液注滿整個葉片。每株植物注射2張葉片作為1個樣品，每次試驗每種材料至少需要6個重復樣品。接種完畢用紙擦干葉片表面殘余菌液，3 d后剪取葉片并將2張葉疊在一起，用直徑為0.74 cm的打孔器獲取樣品放于裝有100 μL滅菌水的離心管中，磨碎樣品后再加900 μL水稀釋后取20 μL菌液涂布平板。2 d后統計平板上長出的菌落數。5 d后觀察發病癥狀。

1.4 實時定量PCR

用液氮速凍聲波處理后的擬南芥葉片，使用總RNA提取試劑盒提取RNA。采用D260 nm/D280 nm評估RNA樣品質量。采用逆轉錄試劑盒將RNA反轉錄成cDNA。相對定量PCR采用試劑盒進行試驗。相對定量PCR引物actin-F：5′-GGAACTGGAATGGTGAAGGCTG-3′，actin-R：5′-CGATTGGATACTTCAGAGTGAGGA-3′，PR1-F：5′-TGGTCACTACACTCAAGTTGTT-3′，PR1-R：5′-GCTTCTCGTTCACATAATTCCC-3′，FRK1-F：5′-TATATGGACACCGCGTATAGTG-3′，FRK1-R：5′-ATAAAACTTTGCGTTAGGGTCG-3′。

1.5 生物信息學分析

1.5.1 轉錄組測序 采用Illumina高通量測序平臺對RNA樣品進行轉錄組測序，得到雙末端讀長 （150 bp）的原始測序數據。為了使后續分析結果更加可靠準確，去除低質量數據和含有接頭污染的數據。隨后使用Tophat軟件將測序讀長匹配到擬南芥的基因上，得到擬南芥每個基因對應的讀長數，并對其進行標準化，即采用每百萬條讀段中來自于某基因每千堿基長度的讀段數（reads per kilobase per million mapped reads，RPKM）代表基因的轉錄表達水平。得到基因的RPKM之后，以2倍作為差異基因篩選條件，并通過Cufflinks軟件進行統計學顯著性分析，以P<0.05、差異表達倍數2倍以上為標準，得到顯著差異表達的基因。

1.5.2 轉錄組和生物信息學分析 GO富集分析使用agriGO（http：//systemsbiology.cau.edu.cn/agriGOv2/index.php）獲得，MapMan分析使用MapMan軟件（https：//mapman.gabipd.org/）進行。

1.5.3 轉錄元件鑒定 提取轉錄組分析中上調表達基因的啟動子區域（1 000 bp），利用MEME軟件的默認參數進行保守motif鑒定。

2 結果與分析

2.1 聲波處理增強了擬南芥對丁香假單胞菌DC3000的抗性

為探究聲波是否影響植物對病原菌的抗性，采用500 Hz恒定頻率與100 dB恒定振幅處理擬南芥30 min。使用丁香假單胞菌DC3000分別接種對照組與處理組，并調查和統計擬南芥發病情況。結果顯示，處理組中接種后的擬南芥葉片的癥狀較輕，而對照組的葉片已經發黃皺縮（圖1-A），癥狀明顯，說明該條件聲波的預處理明顯提高了擬南芥對丁香假單胞菌DC3000的抗性。同時，對葉片中細菌生長量進行進一步測定發現，聲波預處理后的植株葉片中的細菌生長量相比于對照組降低87.5%（圖1-B）。這表明聲波處理可以明顯增強擬南芥對丁香假單胞菌的抗性。

2.2 聲波處理改變了擬南芥轉錄組譜

為進一步揭示聲波促進植物對丁香假單胞菌抗性的機制，利用RNA-seq技術檢測聲波處理前后擬南芥的轉錄組變化。本試驗對2個經過不同處理的樣品進行轉錄本測序，處理組為500 Hz、100 dB聲波處理30 min后的擬南芥，對照組為相同條件下未經聲波處理的擬南芥。對照組與處理組測序后分別共獲得44 395 768、45 668 332個過濾后數據讀段。每個樣品的過濾后數據與參考基因組的平均比對率為83%，表明測序結果可靠。對測序數據進行分析發現，聲波處理后擬南芥共有317個基因發生差異表達（差異顯著性小于0.05，差異倍數大于2），其中232個上調表達基因，85個下調表達基因（圖2-A），約占擬南芥總基因數的0.8%。因為Ghosh等報道了在聲波處理后，EXL1和HSPRO2等關鍵標志S基因上調表達[10]，為驗證本試驗中 RNA-seq的可靠性，對聲波處理的這2個標志基因進行定量試驗。結果表明，EXL1在聲波處理15、30、60 min后分別上調表達2.56、3.72、3.25倍，而HSPRO2在聲波處理 15、30、60 min后分別上調表達2.32、56.72、3.45倍（圖3-A）。這些結果與轉錄組測序結果一致。表明本試驗樣品處理和 RNA-seq結果較可靠。

通過GO富集分析對這些差異表達基因進行富集分析，結果表明它們主要富集于刺激反應（GO：0050896）、應激反應（GO：0006950）、化學刺激反應（GO：0042221）、有機物反應（GO：0010033）、生物刺激反應（GO：0009607）、其他有機體反應（GO：0051707）等重要生物學過程（圖2-B）。轉錄組數據顯示，聲波處理后，擬南芥在刺激反應、應激反應和化學刺激反應等過程中上調基因富集明顯，其抗逆反應相關的通路受到了影響。

2.3 聲波處理激活了擬南芥的基礎防衛反應

對上調表達的基因進行進一步的GO富集分析，找到富集差異基因的GO分類條目，尋找不同樣品的差異基因可能與哪些基因功能的改變有關，結果表明，上調表達基因中防衛反應（GO：0006952）的通路顯著富集。利用MapMan軟件對擬南芥受聲波處理后的防衛通路進行分析發現，大量防衛相關基因上調表達，如病程相關蛋白基因PR1和植物防御素基因PDF1.2等擬南芥防衛反應的標志基因顯著上調，分別上調表達19.62、60.21倍（圖4）。另外，參與質體極性運輸和脫落酸信號途徑、調控植株抗病性的基因PCC1（ID：AT3G22231）上調表達18.84倍;幾丁質酶等防衛基因，如CHI基因（ID：AT1G02360）上調表達17.23倍;NB-LRR基因（ID：AT3G04210、AT1G58170），分別上調表達252、2.49倍。上述結果初步顯示聲波處理激發了植物的抗病防衛信號途徑，為了進一步驗證此結果，利用定時定量PCR技術驗證聲波處理后PR1和PDF1.2基因分別在聲波處理0、15、30、60 min后的表達量，結果表明PR1基因在處理15、30、60 min分別上調表達2.61、634、5.46倍;PDF1.2基因在聲波處理后分別上調表達30.95、4.06、1.50倍;病原菌相關分子模式誘導的植物免疫（PAMP-triggered immunity，PTI）的關鍵基因FRK1同樣上調表達，分別上調表達1.86、2.47、3.76倍（圖3-B）。上述結果顯示，富集在防衛反應相關通路的相關基因上調表達，表明聲波處理可以激活擬南芥的基礎防衛反應。

2.4 受聲波誘導的基因啟動子區域的保守元件的鑒定

為鑒定聲波誘導的啟動子區域的保守元件，分別將上調表達基因和下調表達基因的啟動子區域（1 500 bp）進行提取，利用MEME軟件分析受聲波誘導上調表達的保守轉錄元件和受聲波誘導下調的保守轉錄元件，結果顯示在232個上調表達的基因中，有150個基因的啟動子中含有“TXTXTXXTXX”保守元件（元件1），有114個含有“AAXAXXAAAA”保守元件（元件2），有48個含有“AAXXAGAGAG”保守元件（元件3）（圖5-A），其中，10個基因共同含有這3個保守元件，65個基因同時含有第1個和第2個保守元件，16個基因同時含有第1個和第3個保守元件，17個基因同時含有第2個和第3個保守元件（圖5-B）;在83個下調表達基因的啟動子中沒有發現保守的序列元件。上述結果表明，植物中特異性響應聲波的基因可能受轉錄因子結合特異的轉錄元件調控。

3 討論與結論

聲波無害且易于操控，有可能是未來作物病害控制的一種值得嘗試的簡易方法。了解聲波介導抗性機制將有助于更好地指導農業生產。前人研究發現，聲波處理可以增強植物對灰霉的抗性。但是，對于聲波處理所誘導的抗菌譜的廣度和深度還是了解得不多。因此，本研究在擬南芥中明確了聲波能夠提高植物對細菌的抗性，同時通過轉錄組探究了其作用機制。在植物感知環境刺激后，許多信號以級聯反應的方式傳導，從而調整植物自身相關生命活動。刺激信號的獲取、信號轉導和分子生理反應是植物在刺激作用下依次發生的3個主要階段。在本次研究中，擬南芥在聲波處理后，差異表達的基因數量較少，說明聲波處理對植物的影響并不大。但是，這些差異表達的基因大部分與抗性有關，說明聲波處理可能特異性激活了植物的抗性反應，也解釋了為什么聲波處理會增強植物對細菌的抗性。植物防衛反應的激活常伴隨著許多標志性事件，如鈣瞬變[12]、活性氧爆發[13]、激素水平調整[10，14-15]、離子通道通透性變化[16-17]、轉錄組和蛋白質組改變[18]等，同時發生很多抗病反應標志基因的上調表達[10]。本研究的轉錄組測序結果揭示了與這些標志性細胞活動相關基因在表達譜中的巨大變化，如PR1、PDF1.2和FRK1等基因。定量驗證也保證了轉錄組數據的可信度。同時，為尋找響應聲波誘導的關鍵轉錄因子，本研究對差異表達的基因啟動子進行MEME分析發現3個候選的保守原件，這為今后的研究打下了基礎。

怎樣在提高抗病性的同時不危害植物生長是一直以來的研究難點，植物抗病與生長往往是拮抗的，過度的免疫反應往往導致植物的正常生長受損，帶來不必要的產量損失。而從植物防衛反應的標志基因PR1、PDF1.2和FRK1的誘導表達量來看，聲波誘導的抗性比較微弱，同時足夠植物抵抗細菌侵染。前人已經報道聲波處理可通過“啟動效應”提高植物水楊酸水平[10]。聲波的本質是一種機械振動，最近的研究表明植物在聲波處理后生長增強，且植株在聲波處理后未發現任何細胞分裂素水平的變化[6]。此外細胞分裂素信號的負調節因子RAV1的表達量不變，也表明聲波介導的響應可能與細胞分裂素無關[19]。這個發現為平衡植物抗性和植物生長提供了研究前景。

聲波可以誘導植物的光譜抗性。在前期研究中，擬南芥可以感知昆蟲食草時產生的聲波震動，激活化學防御[5];聲波處理后，擬南芥對灰霉的抗性也顯著增加[10-11]。本試驗驗證了聲波處理同樣可以誘導植物對細菌的抗性。以上數據表明，聲波增強植物的光譜抗性，包括昆蟲、疫霉和細菌。這凸顯出聲波處理在植物病害控制方面的潛力。

通過本研究，揭示了500 Hz的聲波處理可以促進擬南芥對丁香假單胞菌的抗性，并且激活了擬南芥的基礎防衛反應。另外，也尋找到3個可能受聲波誘導的保守元件候選，為今后的研究打下基礎。值得注意的是，之前有研究報道，聲波處理也可以促進擬南芥對死體病原菌的抗性[10]，這表明聲波引起的抗性可能是廣譜的。同時聲波引起的植物抗性反應相對較弱，對植物生長造成的危害就會相對較小。利用聲波干預提高植物抗病性為實現綠色可持續農業提供了一個新的思路。然而，植物響應聲波的分子機制是什么？下游調控通路是如何實現的？這些問題仍待解決，因此本領域須要更進一步的深入研究。

參考文獻：

[1]Chehab E W，Eich E，Braam J. Thigmomorphogenesis：a complex plant response to mechano-stimulation[J]. Journal of Experimental Botany，2008，60（1）：43-56.

[2]Qin Y C，Lee W C，Choi Y C，et al. Biochemical and physiological changes in plants as a result of different sonic exposures[J]. Ultrasonics，2003，41（5）：407-411.

[3]Paul A L，Vallejo-Marín M. Whats the ‘buzz about？ the ecology and evolutionary significance of buzz-pollination[J]. Current Opinion in Plant Biology，2013，16（4）：429-435.

[4]Mishra R C，Ghosh R，Bae H. Plant acoustics：in the search of a sound mechanism for sound signaling in plants[J]. Journal of Experimental Botany，2016，67（15）：4483-4494.

[5]Appel H M，Cocroft R B. Plants respond to leaf vibrations caused by insect herbivore chewing[J]. Oecologia，2014，175（4）：1257-1266.

[6]Wang B C，Shao J P，Li B，et al. Soundwave stimulation triggers the content change of the endogenous hormone of the Chrysanthemum mature callus[J]. Colloids and Surfaces B：Biointerfaces，2004，37（3/4）：107-112.

[7]Gagliano M，Mancuso S，Robert D. Towards understanding plant bioacoustics[J]. Trends in Plant Science，2012，17（6）：323-325.

[8]Reda H H，Hou T Z，Yu-Feng L I，et al. Advances in effects of sound waves on plants[J]. Journal of Integrative Agriculture，2014，13（2）：335-348.

[9]Jeong M J，Cho J I，Park S H，et al. Sound frequencies induce drought tolerance in rice plant[J]. Pakistan Journal of Botany，2014，46（6）：2015-2020.

[10]Ghosh R，Mishra R C，Choi B，et al. Exposure to sound vibrations lead to transcriptomic，proteomic and hormonal changes in Arabidopsis[J]. Scientific Reports，2016，6：33370.

[11]Choi B，Ghosh R，Mayank A G，et al. Positive regulatory role of sound vibration treatment in Arabidopsis thaliana against Botrytis cinerea infection[J]. Scientific Reports，2017，7（1）：43-56.

[12]Liu L，Sonbol F M，Huot B，et al. Salicylic acid receptors activate jasmonic acid signalling through a noncanonical pathway to promote effector-triggered immunity[J]. Nature Communications，2016，7 （1）：1583-1592.

[13]Vos I A，Pieterse C J，Wees S V. Costs and benefits of hormone-regulated plant defences[J]. Plant Pathology，2013，62（S1）：43-55. [HJ2mm]

[14]Ming W，Yang C Y，Wei S H. Enhancement of the differentiation of protocorm-like bodies of Dendrobium officinale to shoots by ultrasound treatment[J]. Journal of Plant Physiology，2012，169（8）：770-774.

[15]Chung H S，Abraham J K，Gao X L，et al. Regulation and function of arabidopsis JASMONATE ZIM-domain genes in response to wounding and herbivory[J]. Plant Physiology，2008，146（3）：952-964.

[16]Zhao H C，Wang B C，Liu B A，et al. The effects of sound stimulation on the permeability of K+ channel of Chrysanthemum callus plasma[J]. Colloids and Surfaces B：Biointerfaces，2002，26（4）：329-333.

[17]Hamilton E S，Schlegel A M，Elizabeth S H. United in diversity：mechanosensitive ion channels in plants[J]. Annual Review of Plant Biology，2015，66（1）：113-137.

[18]Klára K，Pavel V，Ilja T P，et al. Plant proteome changes under abiotic stress-contribution of proteomics studies to understanding plant stress response[J]. Journal of Proteomics，2011，74（8）：1301-1322.

[19]Feng C Z，Chen Y，Wang C，et al. The Arabidopsis RAV1 transcription factor，phosphorylated by SnRK2 kinases，regulates the expression of ABI3，ABI4，and ABI5 during seed germination and early seedling development[J]. The Plant Journal，2014，80（4）：654-668.

收稿日期：2019-08-23

基金項目：國家重點研發計劃（編號：2018YFD0201003）;國家自然科學基金（編號：31625023、31801715）;江蘇省自然科學基金（編號：BK20180518）。

作者簡介：艾 干（1993—），男，江蘇南京人，博士研究生，主要從事植物與微生物互作研究。E-mail：2016102010@njau.edu.cn。

通信作者：景茂峰，博士，副教授，主要從事植物與微生物互作研究。E-mail：jingmf@njau.edu.cn。