中國美利奴羊(新疆軍墾型)同期發情處理前后外周血生殖激素的變化

王晶晶 楊華 倪建宏 盧守亮 支建忠 石國慶 劉長彬 萬鵬程

摘要：研究同期發情處理中國美利奴羊（新疆軍墾型）的外周血生殖激素含量變化與發情時間的關系，探討中國美利奴羊（新疆軍墾型）最佳人工輸精時間。分別采集經孕酮海綿栓+PMSG肌注法處理母羊在埋栓前1 d、埋栓后 7 d、埋栓后13 d（撤栓0 h）和撤栓/PMSG肌注48 h的外周血，應用ELISA方法檢測外周血中雌二醇（E2）、促卵泡素（FSH）、促黃體素（LH）、孕酮（P）的質量濃度，分析試驗母羊在同期發情處理前后外周血中生殖激素含量變化，統計分析生殖激素質量濃度的相關性和4個時間點的差異顯著性。研究結果，對孕酮海綿栓+PMSG肌注法處理前后試驗母羊外周血生殖激素的ELISA檢測，與埋栓前1 d、埋栓后7 d、埋栓后13 d（撤栓0 h）相比，撤栓/PMSG肌注48 h試驗羊外周血中E2、FSH、LH含量顯著升高（P<0.05），P含量顯著下降（P<0.05），且不同個體間不同激素含量的波動范圍明顯減小，達到相對一致水平，與該時間點的中國美利奴羊（新疆軍墾型）集中發情現象相吻合。結果表明，孕酮陰道海綿栓+PMSG處理后的48 h是中國美利奴羊（新疆軍墾型）集中發情的高峰時間，也是最佳輸精時間。

關鍵詞：中國美利奴羊（新疆軍墾型）;同期發情;生殖激素;ELISA;E2;FSH;LH;P

中圖分類號：S826.3?? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）14-0187-05

綿羊同期發情是人為控制母羊群體同一時間發情和配種，具有便于統一飼草料配給、提高勞動生產效率和提高綿羊生殖效率的優點。生殖激素直接調控母羊發情、排卵等生殖過程，影響同期發情和人工授精的效果。綿羊屬于季節性發情動物，一般是在短日照的秋季開始發情[1]，其季節性發情受到下丘腦-垂體-性腺軸的調控[2]，與綿羊的生殖激素有密切聯系。目前，國內外對綿羊生殖激素季節性變化進行了相關報道。Suttie等研究發現，短日照可以促進綿羊孕酮（P）分泌，而長日照則明顯地抑制P的分泌[3];Smith等發現，哺乳動物一般在發情前會出現一次雌二醇（E2）峰[4];Chemineau等研究發現，繁殖季節綿山羊血液中促黃體素（LH）和促卵泡素（FSH）濃度高于非繁殖季節，存在季節性變化[5];賀建寧等研究發現，季節性發情的灘羊的P、E2、LH、FSH濃度在春季、夏季、秋季、冬季4個季節變化明顯[6]。中國美利奴羊（新疆軍墾型）是我國培育的優質細毛羊品種，是典型的季節性發情哺乳動物，且每年產羔1次，每胎多為1羔。為探討綿羊外周血生殖激素含量變化與發情時間的關系，篩選最佳人工輸精時間。本研究分析繁殖季節中國美利奴羊（新疆軍墾型）同期發情處理的不同階段外周血中E2、FSH、LH和P含量的變化情況，以期為提高同期發情和人工授精成功率提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2018年9—11月，試驗動物均采自新疆紫泥泉種羊場，中國美利奴羊（新疆軍墾型）母羊共計480只，平均年齡3歲，平均體質量（38.4±1.4） kg，體格健壯，膘情較好，無生殖道疾病和乳房疾病。生殖、營養、健康等方面狀況良好且個體之間無明顯差異。試驗處理前2周對綿羊做好防疫和驅蟲工作，并加強飼養管理。從中選取20只健康的全舍飼中國美利奴羊（新疆軍墾型）母羊，應用孕酮海綿 栓+330 IU PMSG（孕馬血清促性腺激素）進行同期發情處理，埋栓處理 13 d 后撤栓，撤栓時肌注PMSG 330 IU。自撤栓后24～72 h，每隔12 h進行1次公羊試情，記錄母羊發情時間和發情數量，計算撤栓后72 h內母羊的發情率。血樣采集：在埋栓前1 d、埋栓后7 d、埋栓后13 d（撤栓0 h，PMSG肌注前）、撤栓/PMSG肌注48 h，分別頸靜脈采血 5 mL/只，1 000 g×10 min離心分離血清。

1.2 試驗藥品與主要儀器

1.2.1 主要試劑

孕酮陰道海綿栓，含35 mg氟孕酮，寧波市三生藥業有限公司生產;PMSG，1 000 IU/瓶，寧波市三生藥業有限公司生產;綿羊ELISA檢測試劑盒FSH（RY-12131）、LH（RY-12111）、P（RY-12074）和E2（RY-12134）均購于上海潤裕生物科技有限公司。

1.2.2 主要儀器

酶標儀（Thermo Fisher Scientific，Muhiskanmk3 Inc）美國生產。

1.3 生殖激素的測定

采用ELISA法測定血清中E2、FSH、LH和P的含量。按試劑盒的操作步驟測定D450 nm值，并以D450 nm值為橫坐標，含量為縱坐標繪制標準曲線，計算得到回歸方程。FSH的回歸方程為y=67.352x2+14.563x+2.060，r2=0.994 3;LH的回歸方程為y=103.440 0x2+4.297 8x+1.358 9，r2=0991 8;E2的回歸方程為y=112.900 0x2+25.900 0x+2191 1，r2=0.988 1;P的回歸方程為y=1 773.200x2+3 667.900x-30.839，r2=0.998 7。根據回歸方程計算出E2、FSH、LH和P的含量。

1.4 統計分析

E2、FSH、LH和P的含量以（平均數±標準差）表示，使用SPSS 21.0對不同階段外周血中E2、FSH、LH和P的含量進行方差分析和相關分析，處理0～72 h母羊的發情率進行卡方檢驗，并進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 孕酮海綿栓+PMSG同期發情處理前后的中國美利奴羊（新疆軍墾型）生殖激素含量比較

2.1.1 E2含量 試驗羊外周血E2分泌水平在埋栓前1 d最低，為（28.35±8.58） ng/L，埋栓后7 d有較大幅度升高，為（52.95±8.41） ng/L，埋栓后13 d（撤栓0 h）出現回落，含量為（29.95±11.42） ng/L，撤栓/PMSG肌注48 h后升至最高點，為（60.18±5.87） ng/L（表1）。其中撤栓/PMSG肌注48 h后E2分泌水平與埋栓前1 d、埋栓后7 d、埋栓后13 d（撤栓0 h）相比差異顯著（P<0.05）（圖1）。

2.1.2 FSH含量 試驗羊外周血FSH分泌水平在埋栓前1 d最低，為（21.23±5.54） IU/L，埋栓后 7 d 有所升高，為（25.01±5.00） IU/L，埋栓后13 d（撤栓0 h）出現回落，為（23.57±5.06） IU/L，撤栓/PMSG肌注48 h后升至最高點，為（40.30±307） IU/L（表1）。其中撤栓/PMSG肌注48 h后FSH分泌水平與埋栓前1 d、埋栓后7 d、埋栓后13 d（撤栓0 h）相比差異顯著（P<0.05）（圖1）。

2.1.3 LH含量 試驗羊外周血LH分泌水平在埋栓前1 d最低，為（18.59±9.25） ng/L，埋栓后7 d有所升高，為（21.01±9.93） ng/L，埋栓后13 d（撤栓0 h）出現回落，為（19.54±6.16） ng/L，撤栓/PMSG肌注48 h后LH分泌水平升至最高點，為（29.37±4.55） ng/L（表1），但與埋栓前1 d、埋栓后7 d和埋栓后13 d（撤栓0 h）相比差異均不顯著（P>0.05）（圖1）。

2.1.4 P含量 試驗羊外周血P分泌水平在埋栓前1 d最低，為（2 047.38±949.02） pmol/L，埋栓后7 d達到最高，為（3 300.66±861.46） pmol/L，埋栓后13 d（撤栓0 h）分泌水平下降，為（2 443.59±592.32） pmol/L，撤栓/PMSG肌注48 h后繼續降低至（2 182.49±354.31） pmol/L（表1）。其中埋栓后7 d試驗羊P分泌水平與埋栓前1 d、埋栓后 13 d、撤栓/PMSG肌注48 h相比均差異顯著（P<0.05）（圖1）。

從圖2可以看出，在埋栓前1 d、埋栓后7 d和埋栓后13 d（撤栓0 h）激素分泌水平個體差異較大，撤栓/PMSG肌注48 h后則達到相對均一水平，均值標準差均以埋栓前1 d為最大，撤栓/PMSG肌注48 h最小，說明在經過孕酮海綿栓+PMSG處理后，試驗羊的生殖激素分泌基本達到同步狀態。

2.2 同期發情處理的綿羊LH含量與FSH、E2、P含量之間的相關性分析

經統計分析，孕酮海綿栓+PMSG同期發情處理后，中國美利奴羊（新疆軍墾型）中外周血中E2、FSH、LH、P含量均呈極顯著正相關關系（P<0.01）（表2），其中LH含量與FSH、E2、P含量之間呈中度正相關關系，FSH含量與E2、P含量呈中度正相關關系，E2含量與P含量之間呈低度正相關。

2.3 同期發情處理母羊的發情率

記錄孕酮海綿栓處理的母羊在撤栓后72 h發情率，應用卡方檢驗進行差異顯著性分析。中國美利奴羊（新疆軍墾型）同期發情處理的總發情率是87.5%，撤栓后>24～48 h同期化程度最高，發情率為70.0%，顯著高于0～24 h的7.5%和>48～72 h的10.0%（表3）。

3 討論與結論

同期發情技術在綿羊繁殖過程中被廣泛應用，但影響同期發情的因素很多，導致綿羊發情率存在較大的差別。海綿栓是目前綿羊同期發情中最常用的埋植栓劑，孕酮海綿栓+PMSG肌注法的同期發情處理效果要優于孕酮海綿栓+PG法，孕酮海綿栓與PMSG聯合使用的效果優于單一使用孕酮海綿栓[7]。

Scaramuzzi等檢測結果表明，發情期綿羊的卵巢靜脈和外周靜脈血血漿E2和LH濃度在排卵時顯著升高[8]。張壽等發現，青海半細毛羊的E2濃度水平在發情當日最高，而P濃度水平在發情的前1 d、發情的當天和發情后2 d均較低，發情當天的含量最低，發情后10 d濃度上升[9]。趙松華等研究發現，非繁殖季節中國美利奴羊血清中E2含量顯著上升[10]。本研究中對孕酮海綿栓+PMSG肌注法處理前后試驗母羊外周血生殖激素的ELISA檢測，與埋栓前1 d、埋栓后7 d、埋栓后13 d（撤栓0 h）相比，撤栓/PMSG肌注48 h試驗羊外周血中E2含量顯著升高（P<0.05），且激素含量的波動范圍明顯減小，達到相對一致水平，與該時間點的集中發情現象相吻合，表明撤栓48 h前后是中國美利奴羊（新疆軍墾型）發情、排卵高峰，本試驗結果與孫五洋的結論[11]一致。

Karsch等研究表明，LH峰值出現前48～60 h，黃體開始急劇退化，導致血中P4濃度急劇下降，此時外周血中E2和LH濃度開始緩慢升高，促使垂體釋放大量LH而引起排卵[12]。Martineza lvarez等應用不同處理方法誘導母羊發情時，LH峰出現和排卵時間無關[13]。張英杰等研究發現，全年的高繁殖力小尾寒羊血漿FSH和LH濃度均極顯著高于低繁殖力和季節性發情的細毛羊[14];LH濃度水平通常在發情期呈現最高峰，FSH有相同的高峰趨勢，但不如LH明顯[15]。本研究中對孕酮海綿栓+PMSG肌注法處理前后試驗母羊外周血生殖激素的ELISA檢測，與埋栓前1 d、埋栓后7 d、埋栓后13 d（撤栓 0 h）相比，撤栓/PMSG肌注48 h試驗羊外周血中FSH和LH含量顯著升高（P<0.05），且激素含量的波動范圍明顯減小，達到相對一致水平，與該時間點的集中發情現象相吻合，說明撤栓48 h前后是中國美利奴羊（新疆軍墾型）發情、排卵高峰。張振漢等測得雙羔組發情日血清E2含量是單羔組的15倍，雙羔組母羊在發情日血清LH含量出現峰值后迅速下降，到發情后10 d恢復到發情前1 d的水平，單羔組母羊血清LH峰值出現在發情后1 d[16]。不同動物垂體中FSH/LH的比率及其含量也相同，這與動物的發情時間、排卵時間及發情表現有關[17]。

P的主要作用是“啟動”母羊的發情，促使卵巢從相對靜止狀態轉變為活躍狀態，從而使母羊正常發情和排卵[18]。Carlson等報道，由于與黃體分泌P相疊加，在母羊血漿中P濃度高于植栓后3 d[19]。Theodosiadou等研究結果表明，高劑量P進行誘導發情處理時，會擾亂羊本身體內激素濃度，導致了較低的妊娠率[20]。Karagiannidis等報道，MPA陰道栓植入陰道后1 d，奶中的P濃度水平上升，然后降到一個穩定的水平直到在撤栓后24 h，P水平降到基礎水平[21]。Campbell等報道，植栓的0～1 d P4濃度水平上升，2～3 d P水平下降，9～10 d至撤栓，P維持基礎濃度水平[22]。Lazar等報道，血清中P濃度在撤栓后3 h下降[23]。張海容等證明，在乏情期外周血中P濃度保持較低的水平，在15 d有1個波動周期，在發情后24 h E2濃度上升，P濃度下降[24]。侯衍猛等證明，在發情期和間情期血漿內的FSH和LH濃度均呈脈沖式分泌，E2和P為波動式分泌，P在間情期一直維持較高濃度水平[25]。謝炳坤等研究發現，哺乳動物在發情前后有1個較低的P濃度水平，其變化有利于母畜進入下一個發情周期[26]。王金富等對中國美利奴軍墾型細毛羊發情周期血清中P濃度進行了檢測，結果表明，發情后 1 d P含量顯著高于0 d[27]。

本研究對孕酮海綿栓+PMSG肌注法處理前后試驗母羊外周血生殖激素的ELISA檢測，與埋栓前 1 d、埋栓后7 d、埋栓后13 d（撤栓0 h）相比，撤栓/PMSG肌注48 h試驗羊外周血中P含量顯著下降，且激素含量的波動范圍明顯減小，達到相對一致水平，與該時間點的集中發情現象相吻合，說明撤栓48 h前后是中國美利奴羊（新疆軍墾型）發情、排卵高峰，P含量在撤栓48 h顯著下降，與E2、FSH、LH濃度變化不同，這可能與中國美利奴羊（新疆軍墾型）發情配種后妊娠有關。

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收稿日期：2019-07-22

基金項目：國家重點研發計劃（編號：2017YFD0501904）;國家絨毛用羊產業技術體系（編號：CARS-40-07）;省部共建綿羊遺傳改良與健康養殖國家重點實驗室項目（編號：SKLSGIHP2016A01、SKLSGIHP2017A02）;新疆生產建設兵團科技攻關與成果轉化計劃（編號：2016AC027）;新疆生產建設兵團重大科技項目（編號：2017AA006）。

作者簡介：王晶晶（1995—），女，河南沈丘人，碩士研究生，主要從事動物遺傳育種與繁殖研究。E-mail：2318525314@qq.com。

通信作者：萬鵬程，博士，研究員，主要從事綿羊繁育與家畜胚胎生物技術研究，E-mail：pengcheng.wan@gmail.com;劉長彬，博士，研究員，主要從事綿羊繁育與家畜胚胎生物技術研究，E-mail：xlchangbin@163.com。