一種功能性酸奶的研制及其抗氧化活性

陳玉勝 陳全戰(zhàn)

摘要：以鼠曲草水提物（GAE）和鮮牛奶為主要原料，與保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的混合菌種共發(fā)酵來研制一種功能性酸奶，并研究其品質(zhì)和抗氧化活性。以GAE添加量、蔗糖添加量、接種量、發(fā)酵時間為因素，采用單因素和正交試驗設(shè)計，根據(jù)感官評價和酸度來確定最佳配方和工藝參數(shù)，并進一步通過昆明小鼠體內(nèi)和體外試驗來評價其抗氧化活性。結(jié)果表明，GAE酸奶的最佳工藝配方為1.0% GAE、5%蔗糖、4%接種量，在42 ℃條件下發(fā)酵4 h時酸奶的口感最佳;該酸奶具有顯著的清除ABTS、DPPH以及超氧化物和羥基自由基的能力，顯著提高昆明小鼠血清超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性，顯著降低血清丙二醛含量。通過最佳工藝發(fā)酵而成的高品質(zhì)GAE酸奶具有顯著的抗氧化能力，以及在食品工業(yè)中用作一種新型功能性食品的潛能。

關(guān)鍵詞：功能性酸奶;鼠曲草水提物;共發(fā)酵;最佳工藝;抗氧化;昆明小鼠

中圖分類號： TS201.3;TS252.54? 文獻標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）14-0221-06

鼠曲草是菊科鼠曲草屬2年生草本，別稱鼠麹草、清明菜，是營養(yǎng)價值極高的一種野菜，廣泛用于多種食品生產(chǎn)的原料。鼠曲草還用于治療腫脹、腰痛、炎癥，及呼吸道和心血管疾病[1-2]。鼠曲草多酚含量高，在清除自由基、抑制脂質(zhì)氧化和保護細(xì)胞免受氧化損傷等方面顯示了明顯的抗氧化活性[3]。

酸奶是全球范圍內(nèi)普遍消耗的食品，富含蛋白質(zhì)、脂肪酸、維生素和礦質(zhì)元素等有益于人體健康的成分[4-5]。近10年來，雖然人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用了一些加工技術(shù)，如添加合成化合物來改善酸奶的感官品質(zhì)和功能特性，但它們對人體的潛在毒性和對酸奶營養(yǎng)價值的負(fù)面影響正受到人們的擔(dān)憂和考慮。因此，人們努力從自然來源尋找新型和安全的添加劑[6-9]。

在傳統(tǒng)的生產(chǎn)工藝中，像蔬菜汁、水果顆粒之類添加劑是在發(fā)酵過程結(jié)束后加入酸奶中的。因此，這些植物成分不參與發(fā)酵。這意味著含有植物成分的商業(yè)酸奶實際上是酸奶和植物成分的混合物。最近，相關(guān)研究報道，植物成分有益于人類健康（如抗氧化、抗病毒、抗菌和益生效果）與這些植物活性成分在人的腸道內(nèi)和微生物共同發(fā)酵的結(jié)果密切相關(guān)。這意味著在酸奶發(fā)酵過程中微生物的代謝作用增強了植物成分的生物活性[10-12]。此外，還有一些相關(guān)研究報道，某些蔬菜和水果被認(rèn)為是益生菌，可以作為乳制品的功能成分，有效改善乳制品的口感和質(zhì)地等感官特性[13-14]。利用共發(fā)酵技術(shù)來提高酸奶中添加的蔬菜及水果對人的健康功效就成為可能。本研究目的是制備一種與鼠曲草水提物共發(fā)酵的酸奶，并觀察共發(fā)酵工藝對酸奶質(zhì)量的影響，通過對該新型酸奶的體內(nèi)外抗氧化能力的測定，為其在功能性食品工業(yè)中的潛在應(yīng)用提供相關(guān)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鼠曲草地上部分（葉和花）于2018年3月采自我國南京，由南京曉莊學(xué)院陳全戰(zhàn)教授鑒定。樣本（編號：2018-03-18）風(fēng)干后保存在南京曉莊學(xué)院藥食兩用植物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新實驗室。

所有生物試劑及抗氧化試劑盒（SOD，CAT，GSH-Px，MDA）均購于南京建成生物工程研究所;分析純化學(xué)試劑及蔗糖和脫脂奶粉均為市售;保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌混合菌種在南京曉莊學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院微生物學(xué)實驗室保存。

昆明小鼠購于南京青龍山實驗動物中心，飼喂標(biāo)準(zhǔn)的嚙齒動物顆粒飼料和水。所有動物均置于（25±2） ℃，光照12 h/黑暗12 h，相對濕度45%～55%。所有動物試驗程序均經(jīng)南京曉莊學(xué)院動物保護與使用委員會批準(zhǔn)。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2F型超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司;DHG-9070AD臺式電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，蘇州江東精密儀器有限公司;日本HITACHI CR21N高速冷凍離心機;PHS-3C精密pH值計，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;RE52CS-1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，杭州大衛(wèi)科教儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 鼠曲草水提物（GAE）的制備

200 g鼠曲草風(fēng)干（25 ℃，15 d）后研磨成粉末，過60目篩，取100 g過篩后直徑小于25 mm的小顆粒粉與 2 000 mL 50%（體積分?jǐn)?shù)）的甲醇混勻，并攪拌（25 ℃，24 h）。然后過濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮（45 ℃），抽真空3次，以抽出多余的甲醇。再通過冷凍干燥得凍干粉8.3 g（得率8.3%），于4 ℃冰箱保藏。

1.3.2 功能性酸奶的工藝流程

GAE+蔗糖

↓

脫脂牛奶殺菌→冷卻→混合調(diào)配→接種→發(fā)酵→冷卻后熟→GAE酸奶

將脫脂奶粉與純凈水按一定比例混合，使重組脫脂牛奶的蛋白質(zhì)含量為4.2%，將牛奶置于95 ℃水浴加熱15 min后冷卻到42 ℃。然后，將GAE溶解于無菌水，用0.22 μm濾膜過濾后與蔗糖（2%～6%）按一定比例添加到牛奶中，使GAE的最終質(zhì)量濃度分別達(dá)到0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%。然后，用磁力攪拌器將所有樣品于42 ℃攪拌10 min，以幫助溶解和混勻。將純種保加利亞乳酸桿菌和嗜熱乳酸鏈球菌2種菌的等量混合菌液組成的發(fā)酵劑以3%～7%的接種量加入到以上混合培養(yǎng)基質(zhì)中。所有牛奶樣品在42 ℃條件下孵育發(fā)酵，直至pH值達(dá)到4.50。當(dāng)pH值達(dá)到要求后，將酸奶樣品冷卻至4 ℃，停止發(fā)酵處理。所有酸奶樣品置于4 ℃冰箱貯存1、7、14、21、28 d，其中最佳工藝酸奶及對照（未加GAE）用于pH值、酸度和抗氧化活性等的進一步分析。

1.4 感官評價

評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

1.5 不同因素對GAE酸奶感官品質(zhì)的影響

1.5.1 GAE添加量對酸奶感官品質(zhì)的影響

以100 mL脫脂牛奶為準(zhǔn)，蔗糖添加量4%，接種量4%，42 ℃發(fā)酵4 h，在每100 mL鮮奶中分別添加鼠曲草0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%，按照“1.3.2”節(jié)的工藝流程制作鼠曲草酸奶，并根據(jù)酸奶的口感確定GAE的最佳添加量。

1.5.2 蔗糖的添加量對GAE酸奶感官品質(zhì)的影響

以100 mL鮮奶為準(zhǔn)， GAE添加量1.0%， 接種量4%，42 ℃發(fā)酵4 h，在每100 mL鮮奶中分別添加蔗糖2%、3%、4%、5%、6%，按照“1.3.2”節(jié)的工藝流程制作GAE酸奶，并根據(jù)酸奶的口感確定蔗糖的最佳添加量。

1.5.3 接種量對GAE酸奶感官品質(zhì)的影響

以100 mL鮮奶為準(zhǔn)，在GAE添加量1.0%、蔗糖添加量5%、42 ℃發(fā)酵4 h條件下，在每100 mL鮮奶中分別接種3%、4%、5%、6%、7%的混合菌種進行乳酸發(fā)酵，按照“1.3.2”節(jié)的工藝流程制作GAE酸奶，并根據(jù)酸奶的口感確定最佳接種量。

1.5.4 發(fā)酵時間對GAE酸奶感官品質(zhì)的影響

以100 mL鮮奶為準(zhǔn)，在GAE添加量1.0%、蔗糖添加量5%、接種量5%的條件下，分別在42 ℃發(fā)酵3、4、5、6、7 h，按照“1.3.2”節(jié)的工藝流程制作GAE酸奶，并根據(jù)酸奶的口感確定最佳發(fā)酵時間。

1.6 GAE酸奶pH值和滴定酸度的測定方法

pH值的測定使用pH計，滴定酸度的測定參照文獻[15]的方法，分別取貯存1、7、14、21、28 d的最佳工藝發(fā)酵GAE酸奶樣品各10 g于燒杯中，加入10 mL蒸餾水，振蕩均勻后，滴入2～3滴酚酞指示劑，用0.1 mol/L的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至pH值 8.3±0.01，樣品的酸度表示為每100 g酸奶中乳酸的含量，按公式（1）計算，未加GAE的酸奶作為對照。

滴定酸度（g/100 g）=[SX（]C×Vm[SX）]×0.9。

式中：C表示NaOH的濃度（mol/L），V表示滴定所消耗的NaOH的體積（mL）;m表示樣品質(zhì)量（g）;0.9表示乳酸的換算系數(shù)。

1.7 GAE酸奶體外抗氧化活性測定

對自由基ABTS、DPPH、超氧化物及羥基的清除能力的測定參照文獻[3]的方法。分別取貯存1、7、14、21、28 d的最佳工藝發(fā)酵GAE酸奶樣品各5 g置于離心管中離心（1 500 g，15 min，4 ℃），上清液用于各種指標(biāo)的檢測。未加GAE的酸奶作為對照。

1.8 GAE酸奶體內(nèi)抗氧化活性測定

1.8.1 試驗設(shè)計

30只昆明小鼠[（20±2） g，雌性]適應(yīng)環(huán)境7 d后隨機分成3組（每組10只）：對照組、普通酸奶組、GAE酸奶組，分別灌胃0.9% NaCl溶液、未加GAE的普通酸奶和最佳發(fā)酵工藝GAE酸奶，每天灌胃1次，灌胃體積為10 mL/kg體質(zhì)量，灌胃量10 g/kg體質(zhì)量，連續(xù)灌胃30 d。

1.8.2 生化指標(biāo)的測定

最后1次灌胃前12 h對所有小鼠進行禁食不禁水處理，灌胃后1 h摘眼球取血，并迅速斷頸椎處死，血樣離心（1 500 g，10 min，4 ℃）后收集上清液血清用于抗氧化指標(biāo)的檢測，檢測方法根據(jù)試劑盒法。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同因素對產(chǎn)品感官品質(zhì)的影響

2.1.1 GAE添加量對產(chǎn)品感官品質(zhì)的影響

從圖1可以看出，GAE添加量會明顯改善酸奶發(fā)酵的風(fēng)味和組織狀態(tài)，隨著添加量的增加，酸奶的整體感官品質(zhì)明顯上升。當(dāng)添加量達(dá)到1.0%時，酸奶色澤均勻一致，略帶黃色，香甜可口，細(xì)膩厚實，無凝塊或機械雜質(zhì)。當(dāng)添加量過高，達(dá)到1.2%時，由于發(fā)酵時間過長導(dǎo)致味道略偏酸，不夠細(xì)膩。因此，GAE添加量為1.0%時最佳。

2.1.2 蔗糖添加量對產(chǎn)品感官品質(zhì)的影響

從圖2可以看出，蔗糖添加量明顯影響酸奶的口感，當(dāng)添加量小于4%時，酸奶的甜度不夠，而且過酸;當(dāng)添加量大于4%時，感官評分明顯下降，而且酸奶的口感過于甜膩;只有添加量為4%時，酸奶的口感較好，酸甜適宜，感官評分最高。因此，蔗糖的最佳添加量為4%。

2.1.3 接種量對產(chǎn)品感官品質(zhì)的影響

從圖3可見，接種量過大或過小都會影響酸奶的品質(zhì)，當(dāng)接種量為5%時最佳。接種量過小則會出現(xiàn)凝乳時間長、酸味不足等現(xiàn)象;接種量過大則會出現(xiàn)乳酸菌生長過快、乳清析出較多、質(zhì)地粗糙、口感差等現(xiàn)象。

2.1.4 發(fā)酵時間對產(chǎn)品感官品質(zhì)的影響

從圖4可以看出，發(fā)酵時間過長或過短都影響酸奶的感官品質(zhì)。發(fā)酵時間小于4 h會導(dǎo)致凝乳松軟，滋味較差;大于4 h有水分析出，口感偏酸。而發(fā)酵4 h的酸奶色澤均勻一致，香甜可口，細(xì)膩厚實。因此，發(fā)酵時間4 h的酸奶品質(zhì)最佳，感官評分最高。

2.2 GAE酸奶的工藝優(yōu)化

2.2.1 正交試驗因素

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以

[FK（W10][TPCYS4.tif]

GAE添加量、蔗糖添加量、接種量、發(fā)酵時間為因素，設(shè)計4因素3水平的正交試驗（表2），以感官評分為標(biāo)準(zhǔn)，確定最佳工藝參數(shù)。

2.2.2 GAE酸奶最佳工藝優(yōu)化

從表3可以看出，正交試驗結(jié)果表明，GAE酸奶最優(yōu)組合為A2B2C2D2，與實際最優(yōu)組合一致。

2.3 最佳工藝GAE酸奶pH值和滴定酸度

從表4可以看出，隨著貯存時間的延長，酸奶的pH值逐漸下降，酸度逐漸上升，但在前14 d，pH值及酸度的變化都沒有顯著差異;貯存21 d時，pH值下降不顯著，但酸度顯著上升;當(dāng)貯存到28 d時，pH值及酸度都發(fā)生了顯著和極顯著變化，這可能暗示該酸奶的有效期為14～20 d。整個貯存期間，最佳工藝GAE酸奶和對照之間的pH值及酸度都沒有顯著差異，表明GAE酸奶沒有從酸度上改變口味及品質(zhì)。

2.4 最佳工藝GAE酸奶抗氧化活性

氧化應(yīng)激通常定義為細(xì)胞或個體水平上氧化劑和還原劑的不平衡狀態(tài)。氧化應(yīng)激對人體健康有害，可引起多種慢性疾病，如肌肉變性、心血管疾病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病[16]。雖然服用一些合成抗氧化劑可以有效地抑制氧化過程，但它們對人體具有潛在的毒副作用。因此，通過飲食來提高機體的抗氧化能力是目前對抗氧化應(yīng)激合理可行的方法[17]。在本研究中，與GAE共發(fā)酵的酸奶具有顯著的體外抗氧化能力，且與GAE濃度呈正相關(guān)。

從表5可以看出，當(dāng)GAE濃度達(dá)到0.6%時，自由基清除率與對照相比顯著提高;當(dāng)GAE濃度達(dá)到0.8%及以上時，其清除率更加顯著。

從表6可以看出，1.0% GAE酸奶在貯存 28 d 內(nèi)對ABTS、DPPH、超氧化物及羥基自由基的清除率都顯著高于對照，但與第一天相比，在貯存21 d以后，其對自由基的清除率顯著下降，表明 1.0% GAE酸奶的最佳有效期為14～20 d，此結(jié)果與pH值和滴定酸度結(jié)果相一致。

本研究還通過測定超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）等試驗動物血清主要抗氧化酶的活性，評價酸奶的體內(nèi)抗氧化潛能，這些酶常被用作指示機體產(chǎn)生活性氧（ROS）的生物標(biāo)志物。SOD是ROS清除途徑中的第1個關(guān)鍵酶，CAT、APX、GPX是該途徑的第2個重要酶或關(guān)鍵酶[18]。ROS的產(chǎn)生也是脂質(zhì)過氧化的結(jié)果，丙二醛（MDA）的含量是脂質(zhì)過氧化的重要指標(biāo)。本研究中，與對照組相比，普通酸奶組小鼠血清中抗氧化酶活性沒有發(fā)生顯著變化。而添加量為1.0%的GAE酸奶顯著提高小鼠血清中抗氧化酶的活性，顯著降低MDA含量，從而減輕脂質(zhì)過氧化反應(yīng)（表7）。

3 結(jié)論

根據(jù)單因素試驗和正交試驗及理化指標(biāo)綜合考慮，最終確定鼠曲草水提物（GAE）功能性凝固型酸奶的最佳工藝條件為GAE添加量1.0%、蔗糖添加量5%、接種量4%、在42 ℃條件下發(fā)酵4 h，在此條件下制得的酸奶口感最佳，風(fēng)味獨特，且成本低廉，制備工藝簡單易行，易被生產(chǎn)商和消費者接受。

pH值和滴定酸度結(jié)果與體外抗氧化活性結(jié)果表明，1.0% GAE酸奶有效期長，為14～20 d，且有效期內(nèi)體外抗氧化活性及酸度等保持穩(wěn)定。

動物試驗表明，1.0% GAE酸奶能顯著提高動物體內(nèi)抗氧化酶活性，抑制活性氧的產(chǎn)生和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。該酸奶的體內(nèi)外抗氧化活性可作為一種新型功能性保健酸奶進一步開發(fā)。

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收稿日期：2019-07-07

基金項目：南京市重點學(xué)科項目（編號：NJZDXK201407）。

作者簡介：陳玉勝（1968—），男，江蘇鹽城人，博士，高級實驗師，主要從事營養(yǎng)學(xué)及藥理學(xué)研究。E-mail：cys8691@163.com。