胞嘧啶核苷二磷酸膽堿對(duì)新生大鼠壞死性小腸結(jié)腸炎的治療作用

賴盼建 張維溪 李小兵

壞死性小腸結(jié)腸炎（necrotizing enterocolitis，NEC）是新生兒科常見的急危重癥之一，死亡率高達(dá)20%～30%[1]。近年來(lái)，NEC發(fā)病率有增加趨勢(shì)，可能與其發(fā)病機(jī)制尚不清楚有關(guān)。早產(chǎn)、低體重和配方奶喂養(yǎng)等被認(rèn)為是NEC的高風(fēng)險(xiǎn)因素，與新生兒（尤其是早產(chǎn)兒）腸黏膜損傷有關(guān)。目前臨床上主要采取支持治療，但預(yù)后不理想[2]。現(xiàn)有研究表明，NEC腸黏膜損傷可能是氧自由基介導(dǎo)的炎癥因子釋放的結(jié)果，包括TNF、血小板活化因子、IL等；而且發(fā)現(xiàn)炎癥因子的釋放、炎癥反應(yīng)以及活化的多形核白細(xì)胞的遷移會(huì)導(dǎo)致活性氧過量產(chǎn)生。這些活性物質(zhì)的有害作用通過多種機(jī)制（包括細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化和細(xì)胞蛋白氧化等途徑）損傷細(xì)胞并誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[3]。磷脂酰膽堿是胃腸黏膜屏障的主要脂質(zhì)，對(duì)黏膜有保護(hù)作用，并調(diào)節(jié)炎癥信號(hào)系統(tǒng)。實(shí)驗(yàn)表明，磷脂層缺陷或損傷可引起炎癥，易導(dǎo)致NEC[4]。因此，筆者推測(cè)外源性磷脂酰膽堿對(duì)NEC有一定的治療作用。故本研究擬采用胞嘧啶核苷二磷酸膽堿（CDP-膽堿）干預(yù)NEC新生大鼠模型，以探討CDP-膽堿對(duì)NEC所致的腸道炎癥、腸黏膜損害及壞死的治療作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新生（3日齡）清潔級(jí)SD大鼠40只，由浙江省醫(yī)科院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[許可證號(hào)：scxk（浙）20140001]，均飼養(yǎng)在無(wú)特定病原體環(huán)境中。本研究經(jīng)金華市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審查通過。

1.2 主要試劑與儀器 Beclin-1抗體（ab55878）和LC3Ⅱ抗體（ab128025）購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；驢抗兔二抗（A21206）購(gòu)自美國(guó)Life Technology公司；ELISA試劑盒（CSB-E11987r、CSB-E08055r、CSB-E04640r）購(gòu)自武漢華美生物工程有限公司。顯微鏡（BX53）購(gòu)自日本OLYMPUS公司；酶標(biāo)儀（Model680）購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司。

1.3 動(dòng)物分組及處理 40只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分成4組，每組10只。（1）空白對(duì)照組：正常母鼠喂養(yǎng)，無(wú)任何干預(yù)措施[5]。（2）NEC對(duì)照組：脫離母鼠、采用配方奶進(jìn)行人工滴灌喂養(yǎng)，3次/d；依次用CO2（流量4 L/min）灌籠約10 min（直至動(dòng)物膚色變紫）、O2（流量4 L/min）灌籠約8 min（直到動(dòng)物膚色轉(zhuǎn)紅、呼吸恢復(fù)）、0℃冰箱中放置5 min，每日晨晚各1次，間隔12 h；腹腔注射0.9%氯化鈉注射液，1次/d，劑量30 ml/（kg·d）。（3）CDP-膽堿治療組：脫離母鼠、采用配方奶進(jìn)行人工滴灌喂養(yǎng)，3次/d；依次用CO2（流量4 L/min）灌籠約10 min（直至動(dòng)物膚色變紫）、O2（流量4 L/min）灌籠約8 min（直到動(dòng)物膚色轉(zhuǎn)紅、呼吸恢復(fù)）、0℃冰箱中放置5 min，每日晨晚各1次，間隔12 h；腹腔注射CDP-膽堿注射液（2 ml∶0.1 g，國(guó)藥準(zhǔn)字 H22026207，吉林百年漢克制藥有限公司），1次/d，劑量0.1 ml/（kg·d）。（4）CDP-膽堿對(duì)照組：正常母鼠喂養(yǎng)，同時(shí)腹腔注射CDP-膽堿注射液，1次/d，劑量0.1 ml/（kg·d）。實(shí)驗(yàn)第7天采用腹腔注射過量水合氯醛處死大鼠，打開腹腔并從幽門后5 cm處開始往下取1 cm腸段進(jìn)行腸道組織病理學(xué)觀察，再往下取4 cm腸段進(jìn)行腸道組織細(xì)胞自噬程度檢測(cè)和炎癥因子水平檢測(cè)。

1.4 腸道組織病理學(xué)檢測(cè) 腸段用4%多聚甲醛固定72 h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟包埋，6 μm切片，常規(guī)HE染色，樹膠封片，置于光鏡下觀察并進(jìn)行組織學(xué)評(píng)價(jià)。采用Shiou評(píng)分法[6]：腸黏膜絨毛完整，組織結(jié)構(gòu)正常為0分；輕微的黏膜下和（或）固有層腫脹分離為1分；中度的黏膜下和（或）固有層分離，黏膜下和（或）肌層水腫為2分；重度的黏膜下和（或）固有層分離，黏膜下和（或）肌層水腫，局部絨毛脫落為3分；腸絨毛消失伴腸壞死為4分。

1.5 腸道組織細(xì)胞自噬程度檢測(cè) 采用免疫熒光法。腸道組織常規(guī)切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇復(fù)水，抗原修復(fù)，滴加相應(yīng)的Beclin-1和LC3Ⅱ抗體，4℃孵育過夜，PBS水洗3×3 min，并設(shè)PBS作為陰性對(duì)照；滴加二抗，37 ℃孵育 60 min，PBS 沖洗 3×5 min；4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染核，室溫10 min；甘油PBS封片；置于熒光顯微鏡下觀察。藍(lán)色為細(xì)胞核，綠色熒光為Beclin-1和LC3Ⅱ。Beclin-1和LC3Ⅱ熒光強(qiáng)度越強(qiáng)，表示自噬越嚴(yán)重。

1.6 腸道組織炎癥因子水平檢測(cè) 采用ELISA法。腸段稱重后進(jìn)行勻漿，4℃、12 000 g離心20 min；取上清液檢測(cè)TNF-α、IL-6和IL-1β水平。按照說明書步驟測(cè)定各樣本孔的吸光度（OD），利用標(biāo)準(zhǔn)品的OD值和濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并轉(zhuǎn)化出公式，最后根據(jù)所測(cè)樣本的OD值計(jì)算其濃度。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組大鼠腸道組織病理學(xué)觀察 空白對(duì)照組、CDP-膽堿治療組和CDP-膽堿對(duì)照組大鼠腸黏膜上皮連續(xù)、完整，細(xì)胞與腺體排列規(guī)則，未見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；NEC對(duì)照組大鼠腸絨毛普遍水腫，黏膜及黏膜下層可見以中性粒細(xì)胞為主的大量炎癥細(xì)胞，毛細(xì)血管有擴(kuò)張，血管外可見紅細(xì)胞，部分腸上皮細(xì)胞消失，見圖1（插頁(yè)）。4組大鼠腸道組織Shiou評(píng)分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；其中NEC對(duì)照組 Shiou評(píng)分明顯高于其他3組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；而CDP-膽堿治療組、CDP-膽堿對(duì)照組、空白對(duì)照組之間兩兩比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表1。

表1 4組大鼠腸道組織Shiou評(píng)分比較（分）

2.2 4組大鼠腸道組織細(xì)胞自噬程度比較 在相同檢測(cè)條件下，NEC對(duì)照組大鼠腸道組織Beclin-1、LC3Ⅱ熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，而CDP-膽堿治療組、CDP-膽堿對(duì)照組、空白對(duì)照組間熒光強(qiáng)度差異不明顯，見圖2-3（插頁(yè)）。

圖1 4組大鼠腸道組織病理學(xué)觀察所見（NEC為壞死性小腸結(jié)腸炎，CDP-膽堿為胞嘧啶核苷二磷酸膽堿；a：空白對(duì)照組；b：NEC對(duì)照組；c：CDP- 膽堿治療組；d：CDP- 膽堿對(duì)照組；HE 染色，×200）

圖2 4組大鼠腸道組織Beclin-1熒光強(qiáng)度比較（NEC為壞死性小腸結(jié)腸炎，CDP-膽堿為胞嘧啶核苷二磷酸膽堿；a：空白對(duì)照組；b：NEC對(duì)照組；c：CDP-膽堿治療組；d：CDP-膽堿對(duì)照組；免疫熒光法，×400）

圖3 4組大鼠腸道組織LC3Ⅱ熒光強(qiáng)度比較（NEC為壞死性小腸結(jié)腸炎，CDP-膽堿為胞嘧啶核苷二磷酸膽堿；a：空白對(duì)照組；b：NEC對(duì)照組；c：CDP- 膽堿治療組；d：CDP- 膽堿對(duì)照組；免疫熒光法，×400）

2.3 4組大鼠腸道組織炎癥因子水平比較 4組大鼠腸道組織TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；其中NEC對(duì)照組上述炎癥因子水平均明顯高于其他3組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；而CDP-膽堿治療組、CDP-膽堿對(duì)照組、空白對(duì)照組之間兩兩比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表 2。

表2 4組大鼠腸道組織炎癥因子水平比較（ng/L）

3 討論

NEC是新生兒科常見的胃腸道急危重癥之一，病死率較高。研究表明，NEC腸道組織損害是由于非自然狀態(tài)下的腸道組織受到了傷害性刺激，機(jī)體產(chǎn)生了大量的氧自由基，在氧自由基的介導(dǎo)下各種炎癥因子大量釋放，使腸道組織發(fā)生炎性損害[4]。本研究采用CO2灌籠再轉(zhuǎn)為O2灌籠最后低溫刺激2次/d的干預(yù)方式建立大鼠NEC模型，同時(shí)使用CDP-膽堿治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NEC對(duì)照組腸道組織TNF-α、IL-1β、IL-6水平明顯高于其他3組，提示TNF-α、IL-1β和IL-6等炎癥因子在NEC大鼠的腸道組織損傷甚至細(xì)胞死亡過程中扮演了重要角色。使用CDP-膽堿進(jìn)行干預(yù)后，TNF-α、IL-1β和IL-6等炎癥因子水平明顯下降，提示CDP-膽堿對(duì)改善NEC大鼠的腸道組織炎癥反應(yīng)具有明確的作用。

磷脂酰膽堿是一種位于胃腸道黏膜與黏液層之間的主要脂質(zhì)，對(duì)黏膜具有保護(hù)作用，并調(diào)節(jié)炎癥信號(hào)系統(tǒng)。NEC的發(fā)生與磷脂層缺陷或損傷有關(guān)，有研究表明外源性磷脂酰膽堿給藥對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎具有良好的療效[4-5]。而CDP-膽堿在磷脂酰膽堿的合成中起著重要作用，同時(shí)與甘油二酯水平的升高和游離脂肪酸的降低有關(guān)，臨床上常作為腦細(xì)胞代謝激活劑，特別對(duì)于遲發(fā)性神經(jīng)損傷、防止凋亡調(diào)控因子Caspase-3的活化和減少細(xì)胞凋亡具有重要意義[7-8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CDP-膽堿對(duì)NEC炎癥反應(yīng)有一定的保護(hù)效應(yīng)。Cetinkaya等[9]也報(bào)道了NEC大鼠腸損害時(shí)腸道組織膜磷脂減少，而CDP-膽堿能明顯提高總磷脂和磷脂酰膽堿水平。

研究證實(shí)，早產(chǎn)兒NEC發(fā)病早期往往會(huì)發(fā)生腸黏膜上皮細(xì)胞的通透性增加，該事件會(huì)啟動(dòng)一系列細(xì)胞凋亡過程，同時(shí)出現(xiàn)自噬現(xiàn)象[10]。細(xì)胞中出現(xiàn)自噬體是自噬的標(biāo)志，主要由微管相關(guān)蛋白LC3Ⅱ介導(dǎo)形成[11]。而Beclin-1是Ⅲ型PI3-激酶復(fù)合物的主要成分，在細(xì)胞自噬泡的形成過程中必不可少，被認(rèn)為是一種能代表自噬水平的標(biāo)志物[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，NEC對(duì)照組大鼠腸道組織中微管相關(guān)蛋白LC3Ⅱ及自噬基因Beclin-1熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，而CDP-膽堿治療組、CDP-膽堿對(duì)照組、空白對(duì)照組間熒光強(qiáng)度差異不明顯，提示CDP-膽堿可下調(diào)NEC大鼠腸道組織細(xì)胞自噬水平。已有實(shí)驗(yàn)在NEC動(dòng)物模型中證實(shí)細(xì)胞凋亡是細(xì)胞自噬的一種延續(xù)[10]，提示CDP-膽堿可有效保護(hù)腸道細(xì)胞在病理刺激下的調(diào)亡。另有研究發(fā)現(xiàn)，大鼠NEC疾病模型與臨床病例的回腸部位腸黏膜上皮細(xì)胞自噬過程被激活[13]。

綜上所述，CDP-膽堿能有效抑制TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子的表達(dá)，從而使受損腸道的級(jí)聯(lián)炎癥反應(yīng)難以持續(xù)，同時(shí)還能降低腸黏膜細(xì)胞的自噬水平，從而減少細(xì)胞凋亡，這說明CDP-膽堿對(duì)新生大鼠NEC有明顯治療作用。