miR-301a-3p在胰腺癌中的表達及與患者預后關系的研究

范金斌 胡成俠

胰腺癌在常見的惡性腫瘤中侵襲性較高、預后較差，手術切除是治療胰腺癌的有效方法，但由于缺乏有效的早期診斷方法，導致患者的生存率較低[1]。目前影像學技術和血清學標志物對胰腺癌診斷的敏感度和特異度均有待進一步提高[2-3]。因此，為了改善胰腺癌患者的預后，迫切需要尋找特異度更高、侵襲性更小的診斷標志物。微RNA(miRNA)是一類小分子非編碼RNA，在轉錄后水平上可作為蛋白質編碼基因的內源性調節因子[4]，有望成為疾病新的診斷及預后判斷標志物。miR-301a-3p在多種惡性腫瘤中均存在異常表達[5-6]，但目前其在胰腺癌中表達的相關報道較少。本研究探討了miR-301a-3p在胰腺癌中的表達水平及其與患者預后的關系，以期為胰腺癌的早期干預提供更多依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象

收集2016年1月至2019年1月宿遷市中醫院收治的66例胰腺癌患者的手術病理標本。納入標準：(1)符合2017年《NCCN胰腺癌臨床實踐指南》[7]中有關胰腺癌的診斷標準；(2)接受根治性手術治療；(3)術前未行放射治療、化學治療等抗腫瘤治療；(4)依從性好，隨訪記錄完整。排除標準：(1)非首次診斷的患者；(2)圍手術期死亡者。66例患者中，男性46例，女性20例，平均年齡為(54.5±6.2)歲。另選擇同期在本院行健康體檢的66位志愿者作為健康對照，其中男性42人，女性24人，平均年齡為(52.6±5.8)歲。胰腺癌患者與健康對照組志愿者的性別構成、平均年齡的差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經醫院醫學倫理委員會審查通過。

1.2 血漿及組織中miR-301a-3p檢測

患者入院后3 d內完成靜脈血采集。患者或志愿者均抽取肘正中靜脈血5～10 mL，3 000 r/min離心5 min，分離血漿后低溫凍存?；颊叩慕M織標本保存于本院實驗室，每份樣品均包括腫瘤組織及癌旁組織，癌旁組織定義為距離腫瘤邊緣3 cm內的組織。使用TRIzol試劑盒(購自美國Invitrogen公司)提取組織標本和血液標本中的總RNA，逆轉錄合成cDNA，實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-PCR)法檢測miR-301a-3p相對表達量。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列見表1。RT-RCR反應體積為20 μL，反應條件為95 ℃預變性3 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，共40個循環，設置4個重復孔。以GAPDH作為內參基因，計算Ct值，采用2-△△Ct法檢測miR-301a-3p的相對表達量。

表1 引物序列

1.3 臨床資料收集

收集患者的病歷資料和手術記錄，選取指標包括性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、是否有淋巴結轉移、是否有脈管癌栓、糖類抗原19-9(CA19-9)水平及癌胚抗原(CEA)水平等。CA19-9、CEA水平均以入院后第1次腫瘤標志物檢測結果為參考，入院后在清晨空腹狀態下采集靜脈血，由本院檢驗科完成各項腫瘤標志物的檢測，以CA19-9≥37 U/mL、CEA≥5.0 ng/mL為陽性標準。

1.4 隨訪

采用門診復查或電話的形式進行隨訪。術后每個月隨訪1次，直至隨訪終點或失訪，總生存期(OS)定義為自手術當日至因任何原因死亡的時間。隨訪截止時間為2019年12月31日。

1.5 統計學分析

2 結果

2.1 miR-301a-3p在組織、血漿中的表達水平

miR-301a-3p在胰腺癌腫瘤組織、癌旁組織中的相對表達量分別為10.64±2.12、5.64±1.73，在胰腺癌患者血漿及健康志愿者血漿中的相對表達量分別為5.36±1.13、1.28±0.29，差異均具有統計學意義(P均<0.05)。Spearman等級相關檢驗發現，miR-301a-3p在胰腺癌患者的腫瘤組織與血漿中的表達水平呈正相關關系(r=0.539，P<0.01)。見圖1。

圖1 各組血漿及組織中miR-301a-3p的相對表達量 A 腫瘤組織和癌旁組織 B 胰腺癌患者和健康志愿者的血漿 C 胰腺癌患者的血漿和腫瘤組織

2.2 腫瘤組織中miR-301a-3p的表達水平對臨床病理參數的影響

腫瘤組織中miR-301a-3p的中位表達水平為10.22，以此為標準，將患者分為miR-301a-3p低表達組和miR-301a-3p高表達組。單因素分析結果顯示，與miR-301a-3p高表達組患者相比較，miR-301a-3p低表達組患者中腫瘤直徑<5 cm的患者比例較高，有淋巴結轉移及CA19-9水平升高的患者比例則較低，差異均具有統計學意義(P均<0.05)。見表2。將單因素分析中有意義的指標納入多因素Logistic風險模型，結果顯示腫瘤大小、是否有淋巴結轉移、CA19-9水平是影響腫瘤組織中miR-301a-3p表達水平的獨立危險因素(P<0.05)。見表3。

表2 腫瘤組織中miR-301a-3p表達水平對臨床病理參數影響的單因素分析

表3 腫瘤組織中miR-301a-3p的表達水平對臨床病理參數影響的多因素分析

2.3 血漿miR-301a-3p與腫瘤標志物聯合診斷的價值

因變量為二分類變量，對照組標記為0，胰腺癌組標記為1，自變量為CEA、CA19-9、血漿miR-301a-3p相對表達量。結果顯示，CEA、CA19-9、miR-301a-3p單獨診斷胰腺癌時的ROC曲線下面積(AUC)分別為0.576、0.693、0.757，三者聯合診斷時為0.806，提示聯合診斷的準確度明顯優于單獨診斷。見表4、圖2。

表4 血漿miR-301a-3p與腫瘤標志物聯合診斷的價值

圖2 各指標診斷胰腺癌的ROC曲線

2.4 miR-301a-3p的表達水平對患者OS的影響

Log-rank檢驗發現，血漿miR-301a-3p高表達組患者的OS顯著短于血漿miR-301a-3p低表達組(χ2=5.524，P=0.018)；組織miR-301a-3p高表達組患者的OS顯著短于miR-301a-3p低表達組患者(χ2=22.163，P<0.001)。見圖3。

圖3 miR-301a-3p表達對患者預后的影響 A 血漿miR-301a-3p B 組織miR-301a-3p

3 討論

胰腺癌是一種常見的消化系統腫瘤，具有惡性程度高、預后差、病死率高等特點[8]。流行病學調查顯示，胰腺癌的發病率呈逐年上升趨勢，全世界每年新發胰腺癌20多萬例[9]。手術切除是目前胰腺癌的主要治療手段，但由于局部血管侵犯和遠處轉移，大多數患者并不適合行根治術，只能依靠放射治療、化學治療等輔助手段，這些措施可在一定程度上延長患者的生命，但療效較差[10]。miRNA作為一種內源性非編碼小RNA，具有重要的生物學功能。有多項研究表明，miRNA與胰腺癌的發生、發展密切相關[11-12]。Zhang等[13]的研究發現，miR-301a-3p在結直腸癌組織和細胞系(HT29和SW620)中顯著上調。miR-301a-3p的過表達可明顯促進結直腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲，并抑制其凋亡。同時，上調miR-301a-3p的表達可升高Bax、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)、caspase-9、基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)和MMP-9的表達，使結腸癌細胞的侵襲性更強。目前關于miR-301a-3p與胰腺癌之間關系的報道較少。本研究通過分析胰腺癌組織及患者血漿中miR-301a-3p的表達水平，以期為胰腺癌的臨床治療提供新的思路和方法。

本研究結果指出，miR-301a-3p在胰腺癌腫瘤組織中的相對表達量顯著高于癌旁組織；與健康志愿者相比，胰腺癌患者血漿miR-301a-3p的相對表達量明顯升高，提示胰腺癌會誘導患者機體內miR-301a-3p異常高表達。本研究進一步分析表明，腫瘤大小、是否有淋巴結轉移、CA19-9水平是影響腫瘤組織中miR-301a-3p表達水平的獨立危險因素，提示miR-301a-3p的表達水平與胰腺癌的發生、發展密切相關，且對患者的臨床病理特征有顯著的不良影響。

CEA是從結腸癌和胚胎組織中提取的一種腫瘤相關抗原，是一種具有人類胚胎抗原特性的酸性糖蛋白，存在于內胚層細胞分化而來的腫瘤細胞表面，是細胞膜的結構蛋白。CA19-9屬低聚糖腫瘤相關抗原，是細胞膜上的糖脂質，目前常用于診斷胰腺癌[14]。血清中CA19-9以唾液黏蛋白形式存在，分布于正常成年人的胰腺、膽管上皮等處，是存在于血液循環中的胃腸道腫瘤相關抗原。CEA及CA19-9對胰腺癌的診斷具有一定特異度，但敏感度并不能滿足臨床檢測的需求，并且兩者因其非器官特異性，會影響臨床判斷，因此不能單獨作為胰腺癌的腫瘤標志物。本研究發現，CEA、CA19-9、miR-301a-3p三者聯合檢測診斷胰腺癌的準確度明顯優于單獨診斷，提示CEA、CA19-9及miR-301a-3p雖然在胰腺癌早期診斷方面具有一定的參考價值，但三者均不能單獨作為胰腺癌的早期診斷分子標志物，而三者聯合檢測可有效提高診斷的敏感度及特異度。本研究通過隨訪發現，血漿miR-301a-3p高表達組患者的OS顯著短于血漿miR-301a-3p低表達組，組織miR-301a-3p高表達組患者的OS顯著短于miR-301a-3p低表達組患者，提示miR-301a-3p在組織、血漿中的表達水平均對胰腺癌患者的預后具有良好的指示作用。本研究的不足之處在于樣本量較小，且為單中心研究，今后將收集更多的樣本進一步研究，以期得到更具說服力的證據。