甘露醇和海藻糖對凝血質控品穩定性的影響

謝清泉

【摘 要】：目的：探索甘露醇和海藻糖對凝血質控品穩定性的影響。方法：正常水平Q1由枸櫞酸鈉抗凝管收集正常人志愿獻血后分離得到;異常水平Q2由磷酸鹽緩沖液稀釋Q1得到。分別向Q1和Q2中添加凍干保護劑甘露醇和海藻糖，配制成凝血質控品。隨后考察比較不同組別加速破壞穩定性和復溶穩定性。結果：未添加凍干保護劑凝血質控品，14天加速穩定性和72 h復溶穩定性凝血四項各檢測值降幅超過15%;添加1.5%甘露醇凝血質控品，14天加速穩定性和72 h復溶穩定性凝血四項各檢測值降幅均在15%以內;添加4%海藻糖凝血質控品，72 h復溶穩定性凝血四項各檢測值降幅均在15%以內，但14天加速穩定性不能滿足。結論：甘露醇和海藻糖都能明顯提高凝血質控品的穩定性，其中甘露醇效果較優;兩者組合配制的凝血質控品穩定性均優于伯樂血凝質控品。

【關鍵詞】：甘露醇;海藻糖;凝血質控品;穩定性

【中圖分類號】R43【文獻標識碼】A【文章編號】1672-3783（2020）06-18--01

凝血四項包括凝血酶原時間 （PT）、活化部分凝血活酶時間 （APTT）、凝血酶時間 （TT）、纖維蛋白原 （FIB），屬于檢驗科臨檢檢查項目之一，歸屬于血栓性疾病檢查，為手術前必查項目、血栓前檢查項目及監控臨床口服抗凝藥物患者檢查的項目[1]。這就需要臨床實驗室的檢查結果準確可靠，而檢測結果會受到多種因素的干擾，這就需要臨床實驗室開展室內質量控制，以監測和評價本實驗室的工作質量，決定常規檢驗報告是否能發出[2]。而開展室內質量控制就需要質控品，一般每個臨床實驗室每天需要用質控品監測兩次，質控品使用量較大，同時現有的凝血質控品價格較高，且復溶后保存時間較短，這就給實驗室帶來了巨大的成本壓力，如果凝血質控品效期較長及復溶后能保持較長時間，這就會一定程度上縮減實驗室的檢測成本，因此討論凍干保護劑對凝血質控品穩定性的影響具有比較重要的意義。為此我們研究了糖類凍干保護劑海藻糖和多元醇類甘露醇對凝血質控品穩定性的影響，以期能獲得穩定性好的凝血質控品。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Sysmex全自動血凝分析儀CS-2000i

所用試劑為Siemens凝血酶原時間測定試劑盒 （凝固法），批號：562868;

Siemens活化部分凝血活酶時間測定試劑盒 （凝固法），批號：557279;

Siemens氯化鈣溶液，批號：563828;

Siemens凝血酶時間測定試劑盒 （凝固法），批號：48158;

Siemens纖維蛋白原測定試劑盒 （凝固法），批號：547546;

Siemens Owrens巴比妥緩沖液，批號：554632;

Sysmex清潔液 I，批號：A8024;

Bio-Rad Lyphochek Coagulation Control， Level 1，批號：78461;

Bio-Rad Lyphochek Coagulation Control， Level 2，批號：78462;

1.2材料

正常人血漿是由正常人志愿獻血，枸櫞酸鈉采血管收集后分離得到。

1.3方法

1.3.1 凝血質控品Q1和Q2的配制

Q1是由正常人血漿直接添加凍干保護劑冷凍干燥后得到;Q2是由正常人血漿用磷酸鹽緩沖液稀釋后，添加凍干保護劑冷凍干燥后得到。

1.3.2 加速穩定性

將凝血質控品放到37℃溫箱中放置7 d和14 d后，取新開封復溶質控物與穩定期末質控物同時進行檢測，重復測定3次，其檢測結果的平均值分別記為x0和x，根據公式1計算結果的相對偏差B，要求偏差小于±15%。

公式1：B=（x-x0）/ X0×100%

1.3.3 復溶穩定性

將質控品復溶后在2 ℃～8 ℃下放置24 h和72 h，取新開封復溶質控物與穩定期末質控物同時進行檢測，重復測定3次，其檢測結果分別計算平均值，根據公式1計算結果的相對偏差。

2 結果

2.1不添加凍干保護劑質控品的穩定性檢測

血漿直接配制的Q1和Q2，37℃加速破壞穩定性實驗數據見表1，復溶穩定性數據見表2。由表1數據可得：37℃ 加速7天Q1的PT，APTT和TT三個項目的降幅均在45%以上，Q2的PT值已測不出。而我們自己設定的穩定性降幅標準需在15%以內。37℃ 加速14天Q1和Q2穩定性也不能滿足要求。由表2數據可得：復溶后24 h Q1和Q2的FIB降幅均已超過15%。以上都表明不添加任何凍干保護劑配制的凝血質控品穩定性較差，需要添加凍干保護劑增加穩定性。

2.2 甘露醇對凝血質控品穩定性的影響

為了驗證甘露醇對凝血質控品穩定性的影響，我們分別添加0.5%，1%和1.5%甘露醇配制一批凝血質控品，37℃加速穩定性實驗數據見表3，復溶穩定性數據見表4。由表3數據可得0.5%甘露醇37℃加速7天Q2的FIB降幅為16.61%，已超過15%;1%甘露醇37℃加速7天Q1和Q2凝血四項檢測值降幅均在15%以內，但14天Q1 FIB降幅為15.66%，超過15%;1.5%甘露醇37℃加速7天14天的Q1和Q2的凝血四項檢測值降幅均在15%以內，以上表明隨著甘露醇濃度的提高，凝血質控品加速破壞穩定性逐漸提高，且均優于未添加凍干保護劑批次。此外由表4數據可得：1%和1.5%高濃度甘露醇凝血質控品的Q1與Q2的復溶24 h ， 72 h凝血四項檢測值降幅均在15%以內，且隨著甘露醇濃度的提高，穩定性也逐漸提高，且相比未添加凍干保護劑凝血質控品復溶穩定性也有明顯改善。這可能是因為甘露醇作為填充劑，填充在凝血過程相關蛋白和因子之間，從而降低冷凍干燥過程中產生的凍結應力，低溫應力和干燥應力對蛋白等的損傷，最終提高了凝血質控品的穩定性

2.3 海藻糖對凝血質控品穩定性的影響

為了驗證海藻糖對凝血質控品穩定性的影響，分別添加1%，2%和4%海藻糖配制一批凝血質控品。37℃加速穩定性實驗數據見表5，由表5數據可得，雖然各海藻糖濃度的Q1 Q2的37℃加速7天與14天凝血四項檢測值降幅未都在15%以內，但相比未添加凍干保護劑批次個別項目檢測值達到100%以上，添加海藻糖的凝血質控品穩定性已有明顯提高，且隨著海藻糖濃度的提高凝血四項檢測值降幅越來越低。表明海藻糖在一定程度上能提高凝血質控品穩定性。復溶穩定性數據見表6，由表6數據可得只有4%海藻糖濃度的Q1 Q2的復溶24 h ， 72 h凝血四項檢測值降幅均在15%以內，但三個濃度凝血四項個檢測值降幅整體上明顯低于未添加凍干保護劑批次。再次表明海藻糖在一定程度上能提高凝血質控品穩定性。這可能是因為海藻糖作為凍干保護劑，在凍干過程中與凝血相關蛋白質和因子形成氫鍵或者填充在蛋白質間，形成空隙支撐蛋白質的結構，從而減少冷凍干燥過程中產生的低溫應力，干燥應力和凍結應力對蛋白質造成的損傷，從而提高了凝血質控品穩定性。

2.4 同時添加甘露醇和海藻糖對穩定性的影響

同時1.5%甘露醇和4%海藻糖配制一批凝血質控品，37℃加速穩定性實驗數據見表7，由表7數據可得同時添加海藻糖和甘露醇配制的Q1和Q2，37℃加速7天和14天凝血四項各檢測值降幅均在10%之間，而伯樂的加速14天Q1的APTT降幅為15.16%，Q2的PT降幅為21.75%，均已超過15%。復溶穩定性數據見表8，由表8數據可得同時添加海藻糖和甘露醇的Q1與Q2復溶24 h和96 h，凝血四項各項檢測值降幅均在6%之間，而伯樂的復溶48 h Q2的FIB降幅已達到17.79%。以上表明同時添加1.5%甘露醇和4%海藻糖制備的凝血質控品穩定性均優于伯樂。

3 討論

開展室內質量控制是保證臨床實驗室檢驗結果準確性的基礎，而開展室內質量控制需要高成本的質控品，提高質控品的穩定性能在一定程度上降低實驗室檢測成本。

凍干態的凝血質控品制備過程中需經過冷凍干燥過程，而冷凍干燥過程包括預凍、升華干燥和解吸干燥3 個階段。整個過程中存在低溫應力、凍結應力、干燥應力 （蛋白質表面水分子的缺失） 等，冰晶形成、離子強度增加、pH 值變化等會形成凍結應力，這些應力可能會造成蛋白質失去天然的構象從而失去活性[3-4]。由表1和表2數據可得，未添加凍干保護劑的凝血質控品加速破壞穩定性不能滿足7天，復溶穩定性不能滿足24 h。這可能就是凍干過程中各種應力對凝血酶等相關蛋白質造成損傷，從而造成酶失去活性，最終造成穩定性差。由表5和表6可得，添加4%海藻糖凝血質控品的復溶穩定性能滿足72 h，且加速穩定性凝血四項降幅整體明顯低于未添加凍干保護劑批次，添加海藻糖能明顯提高凝血質控品穩定性。這可能是因為海藻糖等糖類與凝血相關蛋白質形成氫鍵或者作為填充劑填充在凝血相關蛋白質之間，從而保護蛋白質免于冷凍干燥過程中產生的各種應力的損傷，維持凝血相關蛋白活性，從而提高凝血質控品的穩定性。之前就有文獻報道二糖海藻糖能夠與乳酸脫氫酶形成氫鍵，從而使其穩定[5]。純海藻糖在30℃高相對濕度時具有優異的性能，能使β-半乳糖苷酶具有長期儲存穩定性[6]。此外還有文獻報道D-海藻糖使堿性磷酸酶穩定脫水和加熱的能力明顯優于L-海藻糖，但兩種二糖都能為酶提供一定保護[7]。這些都與我們的實驗結果相符。由表3和表4數據可得，添加1.5%甘露醇凝血質控品加速破壞穩定性能滿足14天凝血四項各檢測值降幅均在15%以內，復溶穩定性能滿足72 h，穩定性明顯高于未添加凍干保護劑批次。這可能是因為甘露醇可能填充在凝血酶等蛋白質之間，維持蛋白質結構，從而維持蛋白活性，最終提高凝血質控品穩定性。之前也有文獻報道甘露醇不僅可作為優良的骨架劑使用，而且在還能兼做蛋白質的凍干保護劑[8]。3%甘露醇是重組豬胰蛋白酶理想的凍干保護劑，對于酶活性保留率達 81.3% ～ 101.0%[9]。甘露醇具有低溫保護、容易成型以及形成的共晶物熔化溫度高等特性，常被用于凍干藥品低溫保護劑[10]。最終同時添加4%海藻糖和1.5%甘露醇使凝血質控品37℃加速破壞14天凝血四項各項檢測值降幅在10%以內，復溶96 h穩定性各項檢測值降幅均在6%以內，且優于伯樂凝血質控品穩定性。目前實時穩定性9個月凝血四項各項檢測值降幅均在15%以內。至此，我們確定了一種能應用與臨床實驗室的穩定性較高的凝血質控品配方。這就在一定程度上減少了臨床實驗室所需質控品數量，從而降低了實驗室檢測成本。

參考文獻

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