骨髓間充質干細胞穴位移植對癡呆大鼠內源性神經干細胞增殖分化的影響

李容念 ，趙文博 ，趙平 ，朱偉 ，郭建軍 ，席家祥 ，趙瑞成

(1.湖南中醫藥大學，長沙 410208;2.湖南省中醫藥研究院，長沙 410006;3.河北省尚義縣醫院，張家口 076750)

內源性神經干細胞(neural stem cells， NSCs)在成人腦組織中主要分布于側腦室下層(SVZ)和海馬齒狀回兩處[1]，具有干細胞多分化潛能的生物學特性，可通過定向誘導增殖分化為某種特異神經元以替代損傷神經元，有效治療中樞神經系統退行性疾病[2-3]，故促進內源性 NSC增殖與分化有望成為阿爾茨海默病(Alzheimer's disease， AD)治療的新途徑。本研究擬通過外周少量骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells， BMSC)，利用腧穴激發作用和經絡的循經作用，誘導癡呆大鼠腦內內源性NSC增殖、分化，探討治療AD的新技術與方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

8周齡SPF級SD大鼠50只，體質量(210±20)g，由廣州永諾生物技術有限公司提供，許可證號 SCXK(粵)2013-0034。實驗大鼠在自由飲食、溫度 21℃～27℃、正常環境下飼養 1周后開始實驗，實驗過程遵循湖南中醫藥大學實驗動物倫理規范。

1.2 主要試劑和儀器

Aβ1-42(A118755，阿 拉 丁 );Nestin 抗 體(SC- 23927，Santa cruz);β-Tubulin-Ⅲ(BM3880，博士德生物科技有限公司);MS二抗IgG(Ab150106，Abcam);Rb二抗IgG(AB150074， Abcam);Hoechst 33258(H1399， Invitrogen);SD 大鼠骨髓BMSC細胞(SCSP-402，上海細胞庫);雙臂腦立體定位儀(SA-Ⅱ，廣州必特生物科技有限公司);高速顱骨鉆(JC100A，Saeshin);水迷宮(廣州必特生物科技有限公司);全自動正立熒光顯微鏡(德國CARL ZEISS)。

1.3 模型制備

從50只大鼠中按照隨機數字表法抽取10只大鼠作為對照組，剩余 40只大鼠采用Aβ1-42寡聚體側腦室灌注建立大鼠AD模型[4]。以4%水合氯醛按8 μL/g的劑量腹腔麻醉，動物麻醉后固定于腦立體定位儀上。參考Paxinos和Watson大鼠腦立體定位圖譜，以前囟平面為參考平面，按照海馬CA1區坐標確定進針部位，即前囟后3.8 mm(A/P)，中線旁開2.5 mm(L/R)，前囟下3 mm(H)，兩側各注射溶于PBS的質量濃度為4 g/L的Aβ1-42 1 μL，對照組同以上方法在雙側海馬CA1區各注射1 μL的生理鹽水。

1.4 分組與干預

將40只造模成功的AD大鼠采用隨機數字表法平均分為模型組、風府穴組、足三里穴組、尾靜脈組。大鼠 BMSC細胞復蘇后，采用 Gibco公司 10%FBS的a-MEM培養基于5% CO2、37℃細胞培養箱中正常培養，取對數生長期細胞，胰酶消化成單細胞，再用培養基終止消化，離心去除培養基，最后將細胞重懸于PBS溶液中，調整其密度為2×106個/mL。風府穴組于風府穴向后下方斜刺1 mm注入BMSC 1×106個/500 μL;模型組風府穴注入500 μL生理鹽水，足三里穴組隨機選單側足三里穴進針 3～5 mm注入 BMSC 1×106個/500 μL;尾靜脈組從尾靜脈注入 BMSC 1×106個/500 μL;對照組作為空白對照不做處理;大鼠風府穴位于枕骨頂脊后枕寰關節背凹陷處;足三里穴位于膝關節外側腓骨小頭下約5 mm處。大鼠穴位定位參考《實驗針灸學》相關定位方法[5]。

1.5 樣本采集與處理

各組干預處理 4周后，采用水迷宮行為學檢測各組大鼠學習記憶能力。水迷宮實驗結束后，進行心臟灌注[6]，開顱進行腦組織取材，常規石蠟包埋切片。免疫熒光檢測Nestin、β-Tubulin-Ⅲ蛋白在組織切片中的表達，在全自動正立熒光顯微鏡下觀察 Nestin+、β-Tubulin-Ⅲ+細胞，隨機拍攝 4個不重疊的視野，用Image J軟件計數4個視野下陽性細胞總數，以平均數表示其相應的陽性細胞數[7-8]。

1.6 觀察指標

1.6.1 水迷宮行為學檢測

水迷宮行為學檢測包括定位航行試驗和空間探索試驗，采用大鼠逃避潛伏期(EL值)和120 s內穿越虛擬平臺次數作為檢測指標，以評價大鼠的學習能力和記憶能力。定位航行實驗將各組受試大鼠按順時針的順序分別從水池 4個象限入水點依次放進水中，電腦記錄大鼠120 s內尋找平臺的時間(即為逃避潛伏期，escape latency， EL)，EL 值記錄單位為(s)。空間探索實驗撤去池中平臺，再選擇水池第一象限的同一入水點，然后將大鼠面朝水池壁方向放置水中，電腦記錄大鼠120 s內穿越虛擬平臺(即原平臺位置)次數，并以此評估大鼠的存儲記憶、提取再現的能力。EL值越大、穿越平臺次數越少代表大鼠學習記憶能力愈差。大鼠造模4周后，采用Morris水迷宮行為學測試以評估大鼠AD模型。以對照組大鼠EL的平均值為參考值，計算每只造模大鼠與參考值之差占該大鼠EL的比值，若該值＞20%則納入模型，并統計分析對照組與模型EL值、穿越平臺次數，以判定大鼠AD模型構建是否成功[9-10]。各組大鼠干預處理后，再次進行水迷宮行為學檢測。

1.6.2 Nestin、β-Tubulin-Ⅲ蛋白表達檢測

將組織切片放置恒溫箱中60℃烘烤20 min后，放置于二甲苯Ⅰ、Ⅱ中浸泡 10 min，再將組織切片依次放在無水乙醇、95%乙醇、70%乙醇中各浸泡5 min，PBS洗兩次，每次 5 min。將 0.01 M枸櫞酸鈉緩沖溶液(pH6.0)用電爐加熱至 95℃左右，放入已水化后的組織切片煮沸10～15 min，待緩沖液冷卻后，將切片取出，用PBS洗3次，每次5 min。滴加5%正常山羊血清，室溫封閉1 h，吸去多余液體。于兩張組織切片上分別滴加 Nestin、β-Tubulin-Ⅲ抗體(濃度分別為 1:200，1:100)，放置冰箱4℃過夜，次日37℃復溫45 min，PBS洗3次，每次2 min。各張組織切片上分別滴加相對應的 Alexa555熒光標記的二抗，室溫避光孵育1 h，PBS洗3次，每次2 min。在每張切片上滴加50 μL PBS稀釋 1000倍的 Hoechst，染色 10 min，PBS洗 3次每次2 min，中性樹脂封片，待其凝固后拍照。

1.7 統計學方法

應用Graghpad Prism7.0軟件進行統計學處理。符合正態分布的計量資料以均數±標準差表示，多組完全隨機設計計量資料滿足正態分布及方差齊性檢驗，采用單因素方差分析組間差異，進一步組間比較采用Tukey法檢驗。以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組大鼠造模后EL值、穿越平臺次數比較

與正常組比較，模型組EL值顯著增加(P＜0.01)，穿越平臺次數顯著減少(P＜0.001)。詳見表1。

表1 兩組大鼠造模后EL值、穿越平臺次數比較 (±s)

表1 兩組大鼠造模后EL值、穿越平臺次數比較 (±s)

注:與對照組比較1)P＜0.01

組別 n EL(s) 穿越平臺次數(次)對照組 10 26.03±1.32 9.20±1.69模型組 10 48.74±5.801) 3.30±1.341)

2.2 各組大鼠干預后EL值、穿越平臺次數比較

與模型組比較，大鼠BMSC穴位移植后風府穴組的EL值無明顯降低(P＞0.05)，穿越平臺次數無明顯增加(P＞0.05);而尾靜脈組的EL值顯著降低(P＜0.01)，穿越平臺次數顯著增加(P＜0.01)。與對照組比較，尾靜脈組 EL值顯著延長(P＜0.01)，穿越平臺次數減少(P＜0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠干預后EL值、穿越平臺次數比較 (±s)

表2 各組大鼠干預后EL值、穿越平臺次數比較 (±s)

注:與對照組比較 1)P＜0.05，2)P＜0.01;與模型組比較 3)P＜0.01;與風府穴組比較 4)P＜0.05，5)P＜0.01;與足三里組比較6)P＜0.01

組別 n EL(s) 穿越平臺次數(次)對照組 10 27.19±2.11 9.50±1.35模型組 10 45.87±1.862) 3.50±1.272)風府穴組 10 42.19±1.632) 4.80±1.232)足三里組 10 44.59±4.202) 4.10±1.662)尾靜脈組 10 35.54±1.892)3)4)6) 7.30±2.001)3)5)6)

2.3 各組大鼠干預后海馬區 Nestin、β-Tubulin-Ⅲ蛋白的表達

采用免疫熒光法檢測各組大鼠海馬區 Nestin、β-Tubulin-Ⅲ蛋白的表達，評估大鼠BMSC風府穴穴位移植干預治療對 AD大鼠海馬區內源性神經干細胞增殖與分化的影響。與模型組比較，風府穴組Nestin細胞數增加(P＜0.05)，尾靜脈組增加(P＜0.01)，足三里組無明顯變化(P＞0.05);與尾靜脈比較，風府穴組Nestin+細胞數無明顯差異(P＞0.05);表明大鼠BMSF風府穴穴位移植能促進海馬區內源性神經干細胞增殖，效果與尾靜脈組相當。詳見圖1，表3。

β-Tubulin-Ⅲ蛋白表達，顯微鏡下細胞膜或胞質顯紅色者為β-Tubulin-Ⅲ+細胞，見圖 2，細胞計數見表 4。與模型組比較，風府穴組β-Tubulin-Ⅲ+細胞數無明顯增加(P＞0.05)。

圖1 熒光顯微鏡下各組Nestin+細胞

圖2 熒光顯微鏡下各組β-Tubulin-Ⅲ+細胞

表3 各組大鼠干預后Nestin+細胞個數 (±s，個)

表3 各組大鼠干預后Nestin+細胞個數 (±s，個)

注:與模型組比較 1)P＜0.05，2)P＜0.01;與風府穴組比較 3)P＜0.01;與足三里組比較4)P＜0.01

組別 n 細胞個數對照組 10 8.00±0.82模型組 10 5.00±1.47風府穴組 10 9.13±2.101)足三里組 10 4.75±1.713)尾靜脈組 10 10.50±2.082)4)

表4 各組大鼠干預后β-Tubulin-Ⅲ+細胞個數(±s，個)

表4 各組大鼠干預后β-Tubulin-Ⅲ+細胞個數(±s，個)

注:與對照組比較 1)P＜0.05，2)P＜0.01;與模型組比較 3)P＜0.01

組別 n 細胞個數對照組 10 15.50±2.08模型組 10 5.25±2.222)風府穴組 10 8.50±1.292)足三里組 10 7.25±1.502)尾靜脈組 10 11.00±1.831)3)

3 討論

阿爾茨海默病是以海馬神經元和突觸的變性、丟失等病理改變為特征的一種與老化密切相關的中樞神經退行性疾病。該病致死、致殘率高，隨著人口老齡化的加劇，AD的治療已成為社會關注的熱點問題。目前研究證實，神經干細胞移植或小分子藥物影響神經干細胞再生可能成為AD治療的新途徑[11]。

3.1 神經干細胞移植與穴位移植

NSC有進一步分化為神經細胞的潛能，這與其特性有關，包括自我更新，NSC具有對稱分裂及不對稱分裂兩種分裂方式，從而保持干細胞庫穩定;多向分化潛能，NSC可以向神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞分化;低免疫源性，NSC是未分化的原始細胞，不表達成熟的細胞抗原，不被免疫系統識別;組織融合性好，可以與宿主的神經組織良好融合，并在宿主體內長期存活。BMSC同樣具有干細胞特性，與NSC比較BMSC來源廣泛、便于提取、純化，采用BMSC做為干細胞移植，更具有可行性[12]。神經干細胞移植開創 AD等神經變性性疾病治療的新途徑，目前動物實驗及臨床應用中所使用的干細胞移植方法主要包括立體定向腦內注射移植、脊髓局部注射移植、腰椎穿刺蛛網膜下腔注射移植、腦室穿刺注射移植、枕大池穿刺移植、靜脈內注射移植和動脈內注射移植。但每種方法均有優、缺點，且多數方法難以直接應用于臨床。例如立體定向腦內注射移植、脊髓局部注射移植、腦室穿刺注射移植、枕大池穿刺移植等對神經系統損傷太大;腰椎穿刺蛛網膜下腔注射移植需透過腦脊液-腦屏障、靜脈內注射移植和動脈內注射移植不僅移程長，還需透過血腦屏障(BBB)，造成移行過程中干細胞損失太多。所以將外源性神經干細胞直接移植宿主神經系統，應用于臨床并非易事，而且外源性神經干細胞直接移植宿主有致瘤性。本研究采用穴位移植方法，通過外周少量BMSC刺激作用，利用腧穴激發作用和經絡循經作用，誘導腦內內源性 NSC增殖，可突破上述神經干細胞移植方法的局限性。經實驗證實 BMSC通過風府穴與尾靜脈移植均能誘導癡呆大鼠海馬區內源性NSC增殖。

3.2 阿爾茨海默病與督脈風府穴

AD屬于中醫學“呆病”“癲證”“健忘”等范疇。病位在腦，病機為本虛標實，以腎虛致衰的學說為最[13]。《素問·脈要精微論》:“頭者，精明之府”;《靈樞·海論》:“腦為髓之海”，腎主骨生髓，所以腦與腎關系密切;腦為奇恒之府，與奇經八脈的氣血功能密切相關，其中尤以與督脈關系為最[14]。其次，頭為諸陽之會，五臟六腑之清陽皆會聚于腦，而督脈為陽經之海，總督諸陽經，與腦、脊髓等關系相當密切，故歷代醫家素有“病變在腦，首取督脈”之說[15]。

經絡學說認為“督脈起于胞中，下出會陰，后行于腰背正中，循脊柱上行，經項部至風府穴，進入腦內……”，《難經·二十八難》:“督脈者，上至風府，入屬于腦”。說明風府穴是督脈經氣進入腦內的“門戶”。風府穴在項部，當后發際正中直上1寸，枕外隆凸直下，兩側斜方肌之間的凹陷中，深面正對延髓，位于頸脊頂部，周圍有神經根分布。針刺風府穴可“通關開竅”，具有補髓益精、醒神開竅之功，現代醫家運用毫針、電針、溫針、灸法、穴位注射以及針藥并用等方法治療 AD[16]。風府穴也是臨床與動物研究常用穴位，目前實驗證實電針風府穴能使AD模型大鼠海馬區腦源性神經營養因子(BDNF)及其受體TrkB與cAMP反應元件結合蛋白(GDNF)及其受體 GFR-α1表達水平增高，提示對膽堿能神經元有保護作用[17]。但風府穴在腦內內源性NSC增殖分化方面的研究尚不深入。

現代醫學證實，由于血腦屏障(BBB)的存在，高達95%的靜脈給藥被阻擋于腦、脊髓之外。但部分腦脊區缺乏 BBB，與外周神經不同，脊神經根缺乏神經外膜和神經束膜，故沒有神經束膜屏障功能，從而易受周圍環境因素變化的影響。風府穴周圍即分布有頸脊神經根。位于人體正中線上的“無屏障腦區、嗅黏膜-嗅球-SVZ入腦途徑”是目前發現的外界物質入腦的最直接的解剖學證據[18]。這與中醫學督脈的經絡循行高度吻合，是督脈入腦的生理學與解剖學依據。選擇督脈風府穴進行干細胞穴位移植，產生的局部刺激信息，抑或反應物，可能通過“無屏障腦區、嗅黏膜-嗅球-SVZ入腦途徑”進入腦內SVZ，誘導內源性NSC增殖。本研究證實 BMSC風府穴穴位移植誘導癡呆大鼠海馬區內源性NSC增殖作用與尾靜脈移植相當。

3.3 阿爾茨海默病與中醫刺灸療法

AD是一個多病因的神經退行性疾病，炎癥與氧化應激、代謝障礙、鈣離子通道受損、線粒體障礙、神經營養因子缺乏等都與 AD的發生密切相關[19]。中醫刺灸療法可通過多途徑、多靶點改善 AD動物模型的學習記憶能力[20]。艾灸可改善小鼠的記憶學習能力，其機制可能與減少大腦額葉皮層及海馬區的 Aβ沉積有關[21]。針刺可調控p38 MAPK通路，降低AD大鼠海馬區磷酸化Tau蛋白的表達[22]。電針可抑制神經細胞凋亡、促進中樞神經傳遞、調節能量代謝等[23-24]。穴位注射具備藥物和針刺的雙重功效，在治療阿爾茨海默病方面仍需要進一步探究[25]。本項目采用生理鹽水風府穴穴位注射，從內源性 NSC增殖角度與對照組沒有明顯區別，但不能證實穴位注射療法沒有其他作用。

3.4 神經干細胞與神經細胞定向分化

學習記憶是一個復雜的過程，突觸改變是水迷宮記憶形成的神經生物學基礎[26]，移植的神經干細胞定向分化為成熟神經細胞，整合進入宿主的腦組織，或分泌神經遞質促進神經系統的修復才能產生有益效果。而神經干細胞定向分化是一個復雜的過程，且神經干細胞增殖不一定與成熟神經細胞分化同步。研究發現AD患者海馬區NSCs的數量和未成熟神經元標志蛋白表達增加，但成熟神經元標志蛋白沒有增加[27]。成熟的神經元減少，不能完成相應的信號傳導，導致學習和記憶障礙。移植的NSCs能夠分化成熟神經細胞，但分化速度緩慢，且NSCs的分化與腦內微環境有關[28]。與上述研究結論相類似，本研究 AD大鼠學習記憶能力，風府穴組改善不明顯，不及尾靜脈組，可能與其促進增殖的內源性NSC向成熟神經細胞分化不明顯有關。尾靜脈組因BMSC直接注入血液，有可能改善了NSCs分化的腦內微環境，故其成熟細胞分化明顯。這就提示BMSC穴位移植聯合神經生長因子可能會改善NSCs向成熟神經細胞的定向分化。而 BMSC風府穴穴位移植誘導癡呆大鼠海馬區內源性NSC增殖的分子機制與調控機制，有待進一步研究。