宏基因組第二代測序技術在神經外科顱內感染病原學診斷中的應用初探

徐躍嶠 齊猛 尚峰 楊昆 洪韜 曲鑫 王寧

神經外科手術后并發顱內感染可使患者病情加重，治療十分棘手，病死率高達15%～30%［1］，早期診斷、明確病原菌、合理應用抗生素，對改善患者預后具有重要意義。然而，目前針對腦脊液病原菌的檢查方法，如細菌涂片和細菌培養不僅陽性檢出率低且時間較長，許多患者由于無法獲得明確的病原學診斷而被迫接受經驗性大劑量、“廣覆蓋”抗生素治療，導致抗生素過度應用，給患者造成嚴重的經濟負擔甚至醫原性損害。除此之外，還有一些疑似顱內感染的患者，可出現腦脊液白細胞計數增加、葡萄糖下降等異常變化，如何及時與蛛網膜下腔出血、神經外科手術后腦脊液改變或無菌性腦膜炎相鑒別，長期以來一直是困擾神經外科醫師的難題。目前，基于宏基因組的第二代測序技術（mNGS）已成功用于腫瘤基因檢測、無創性產前診斷等領域，在感染性疾病診治中的應用也日益受到重視，據文獻報道，感染性心內膜炎的mNGS陽性檢出率高于血培養和微生物病原學檢測［2］。因此推測，針對腦脊液細菌培養周期長和陽性檢出率低的缺陷，mNGS技術可能具有補充作用，但迄今尚無這方面的文獻報道。首都醫科大學宣武醫院神經外科自2019年初開始嘗試將mNGS技術應用于神經外科手術后并發顱內感染的早期診斷，初步探討其臨床應用價值。

資料與方法

一、臨床資料

1．診斷標準顱內感染的診斷參照《中國神經外科重癥患者感染診治專家共識（2017）》［3］標準，符合以下4項者臨床確診顱內感染：（1）臨床表現，意識及精神狀態改變，顱內壓增高癥狀與體征，腦膜刺激征陽性，同時伴顱內炎癥反應導致的局灶性癥狀，全身感染癥狀表現為體溫異常（＞38℃或＜36℃）、白細胞計數增加、心率和呼吸增快等。（2）影像學表現，頭部CT和（或）MRI可見腦組織炎癥性改變。（3）血清學檢測，白細胞計數＞10×109/L或中性粒細胞比例＞0．80。（4）腰椎穿刺腦脊液檢查，顱內壓＞200 mm H2O（1 mm H2O=9．81×10-3kPa）；急性期外觀渾濁、黃色或典型膿性，慢性期在炎癥局限性包裹的情況下可清亮透明；白細胞計數＞（100～1000）×106/L、多核細胞比例＞0．70。對于癥狀與體征不典型的病例，入組滿3周時由3位神經外科專家對其臨床資料進行回顧分析，根據病情進展和實驗室檢查結果綜合判斷并做出診斷。

2．納入與排除標準（1）臨床疑似顱內感染：體溫＞38℃且持續時間＞48 h；頸項強直；腰椎穿刺腦脊液白細胞計數增加（＞100×106/L）、葡萄糖降低（＜2．60 mmol/L）。（2）年齡≥18歲。（3）既往有神經外科手術、腰椎穿刺或腦室引流等有創性治療史。（4）臨床確診顱內感染或近6個月內有明確中樞神經系統感染史患者均非本研究觀察對象。（5）本研究經首都醫科大學宣武醫院道德倫理委員會審核批準［審批號：臨研審（2017）072］。（6）所有患者及其家屬對檢測項目知情并簽署知情同意書。

3．一般資料前瞻性納入2019年1-10月在我院神經外科住院治療且擬診術后顱內感染患者共15例，男性9例，女性6例；年齡33～80歲，平均（54．21±14．92）歲。原發病分別為動脈瘤性蛛網膜下腔出血（9例）、顱腦創傷后腦積水（1例）、硬脊膜外膿腫合并腦脊液漏（1例）、靜脈竇血栓形成合并腦出血（1例）、腦室出血（1例）、聽神經瘤術后（1例）和面肌痙攣減壓術后（1例）。

二、研究方法

1．腦脊液檢測（1）顱內感染常規檢測：腰椎穿刺抽取腦脊液10 ml，分別行常規、生化、細菌涂片和細菌培養。其中，細菌培養需腦脊液標本4 ml，在無菌操作下注入需氧血培養瓶中，常溫下2 h內送檢。（2）基因檢測：腰椎穿刺抽取腦脊液1．50 ml，置于-20℃無菌離心管保存，24 h內送檢（干冰運輸），由迪飛醫學科技（南京）有限公司進行腦脊液mNGS測序。取腦脊液1 ml，采用混懸液提取基因組DNA，經DNA質檢后進入建庫流程，文庫質檢后采用Illumina Nextseq 550Dx平臺進行測序。下機數據剔除人源序列，將非人源序列與病原微生物數據庫比對，計算序列數和相對豐度。根據生物信息分析列表，結合大樣本分析獲得黑名單和白名單，A針對結核分枝桿菌、諾卡菌和嗜肺軍團菌，檢出1條特異性序列即為陽性；B針對其他細菌、真菌、病毒和寄生蟲，檢出3條非重復特異性序列即為陽性；C的物種檢出序列數小于其在陰性對照中的10倍，則剔除該物種。按照上述閾值篩選病原微生物列表和疑似背景微生物列表，并輔以序列數和結果注釋。mNGS序列數＞100為基因檢測呈陽性。

2．血清學檢測采集初次擬診顱內感染患者的外周靜脈血共10 ml，分別行血常規、生化、C-反應蛋白（CRP，1～8 mg/L）和降鈣素原（PCT，＜0．05 ng/ml）測定。

3．治療方法根據患者病情嚴重程度采取經驗性抗生素治療，首選萬古霉素1 g/次（2次/d）和美羅培南2 g/次（3次/d）靜脈滴注，治療3 d后癥狀明顯減輕或消失，連續檢測腦脊液白細胞計數持續減少、葡萄糖恢復至正常值范圍，腦脊液細菌涂片和細菌培養均呈陰性者，排除顱內感染，停用抗生素。對于腦脊液細菌涂片、細菌培養和mNGS測序均呈陰性者，若臨床癥狀持續或加重，腦脊液白細胞計數不降或持續增加、葡萄糖水平不升或持續降低，仍支持顱內感染診斷，繼續原定抗感染方案或聯合其他抗生素治療；而腦脊液細菌涂片和細菌培養均呈陽性患者，需結合病情嚴重程度，根據病原學檢查結果合理選擇抗生素治療。

4．統計分析方法采用SPSS 22．0統計軟件進行數據處理與分析。計數資料以相對數構成比（%）或率（%）表示，采用χ2檢驗；呈正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，采用兩獨立樣本的t檢驗。以P≤0．05為差異具有統計學意義。

表1腦脊液mNGS測序診斷術后顱內感染的靈敏度和特異度Table 1. Sensitivity and specificity of CSF mNGS sequencing in the diagnosis of intracranial infection after neurosurgery

結 果

15例患者最終確診顱內感染8例，其中4例腦脊液mNGS測序呈陽性（序列數分別為212、329、1601和5371），病原菌檢測分別包括鮑曼不動桿菌（2例）、皮特不動桿菌（1例）和產氣腸桿菌（1例），與腦脊液細菌培養結果一致，同時伴腦脊液白細胞計數增加［分別為（1481、9722、3481、131）×106/L］和葡萄糖降低（分別為2．53、0．02、0．91、1．60 mmol/L）。其余4例經為期2周隨訪，臨床確診為顱內感染，但腦脊液細菌培養和mNGS測序均呈陰性，其中1例發熱次日腦脊液細菌涂片呈陽性（陽性球菌），但細菌培養和mNGS測序呈陰性；3例臨床診斷明確，但腦脊液細菌涂片、細菌培養和mNGS測序均呈陰性，考慮為采集腦脊液標本時已接受抗生素經驗性治療并臨床癥狀好轉，與標本中細菌量不足有關。臨床診斷為無菌性腦膜炎7例，其中3例腦脊液mNGS測序測得背景細菌基因序列，但序列數均＜100；1例蛛網膜下腔出血伴急性腦積水行腦室外引流術患者，引流8 d后拔除引流管，管頭細菌培養為表皮葡萄球菌，但mGNS測序呈陰性，隨訪2周，無感染癥狀，確診管頭細菌培養陽性為表皮葡萄球菌污染所致。腦脊液mNGS測序診斷術后顱內感染靈敏度為4/8、特異度為7/7，準確率為11/15（表1）。8例臨床確診術后顱內感染患者的臨床資料參見表2。

典型病例

患者女性，39歲。因動脈瘤性蛛網膜下腔出血術后2個月，左側顱骨缺損伴腦積水、右側硬膜下積液需手術治療，于2019年1月3日入院，并于1月15日行腰大池引流術，1月18日再次行顱骨修補術。引流術后7天出現發熱，體溫最高達39．2℃，呈弛張熱，伴頸項強直，擬診術后顱內感染。遂于1月22日行腰椎穿刺抽取腦脊液10 ml，外觀渾濁，細胞總數11 322×106/L、白細胞計數9722×106/L、分葉核中性粒細胞比例0．86，葡萄糖低至0．02 mmol/L；細菌涂片可見革蘭陰性球菌和桿菌生長；mNGS測序提示病原菌為鮑曼不動桿菌，序列數為1601（圖1）；多次細菌培養均證實為鮑曼不動桿菌。血清學檢查：白細胞計數15．34×109/L、中性粒細胞比例0．887，C-反應蛋白27．20 mg/L。臨床確診為術后顱內感染，病原菌為鮑曼不動桿菌。遂予以美羅培南2 g/次（3次/d）靜脈滴注，替加環素50 mg/次（2次/d）靜脈滴注、5 mg腦室內注射，連續3周，以及多粘菌素B 50 mg/次（2次/d）靜脈滴注、5 mg/次（2次/d）鞘內注射，連續治療5天，顱內感染癥狀顯著好轉。由于存在腦積水，擬進一步行腦室-腹腔分流術。治療3周后復查腦脊液細菌培養呈陰性，mNGS測序鮑曼不動桿菌序列數為8，結合腦脊液外觀清亮、白細胞計數和葡萄糖均于正常值范圍，考慮顱內感染治愈，于3月8日行腦室-腹腔分流術，術后未再發生顱內感染。

表2 8例臨床確診術后顱內感染患者的臨床資料Table 2.Clinical data of 8 patients with intracranial infection after neurosurgery

討 論

基于神經外科開顱手術對蛛網膜下腔和腦組織結構的影響，以及手術所用人工材料引起的異物反應，均可能是術后誘發無菌性腦膜炎的原因；臨床主要表現為發熱、頭痛或頸項強直等，這些癥狀通常也是術后細菌性腦膜炎的表現，僅根據癥狀與體征難以對細菌性腦膜炎與無菌性腦膜炎進行早期鑒別，而二者治療方案完全不同。因此，如何對術后細菌性腦膜炎與無菌性腦膜炎做出快速鑒別診斷，是神經外科最迫切的需求之一［4］，也是一直以來神經外科與臨床微生物學研究的熱點［5］。目前腦脊液常規、生化、細菌涂片和細菌培養均無法滿足這一早期鑒別診斷的需求，已知的檢測技術主要有基因芯片［6］、多模態檢測［4］等，目前尚未廣泛應用于臨床。

本研究對腦脊液mNGS測序診斷術后顱內感染的價值進行初步探討，其結果顯示，腦脊液mNGS測序與腦脊液細菌培養符合率較好。本組15例患者中8例臨床確診為顱內感染，其中4例腦脊液mNGS測序和細菌培養均呈陽性，其余4例經隨訪也臨床確診為顱內感染，但腦脊液mNGS測序和細菌培養均呈陰性，考慮與留取標本時已應用抗生素經驗性治療，標本中細菌量不足有關。提示對于臨床疑似顱內感染的患者應盡量在抗生素經驗性治療之前采集腦脊液標本，或感染早期腦脊液存在細菌量相對較多時留取標本。鮑曼不動桿菌感染患者治愈后，其腦脊液mNGS測序仍能測出少量序列數，考慮為細菌DNA片段殘留，但數量極少。本組有1例腰大池引流術+顱骨修補術后鮑曼不動桿菌感染患者，抗生素治療3周后復查mNGS測序，鮑曼不動桿菌序列數為8，結合復查細菌培養陰性，以及腦脊液外觀、常規和生化指標均正常，考慮顱內感染治愈，進一步行腦室-腹腔分流術，術后未再發生顱內感染，證實顱內感染治愈，提示mNGS測序有助于判斷顱內感染后腦室-腹腔分流術的時機。

圖1腦脊液mNGS測序檢測鮑曼不動桿菌特異性序列數為1601，基因組覆蓋度為23．02%Figure 1 CSF mNGS showed the specific sequence number of Acinetobacter baumannii was 1601,and the genome coverage was 23．02%．

神經外科術后易導致顱內感染的致病菌主要包括表皮葡萄球菌、不動桿菌或肺炎克雷伯桿菌等，其中尤以鮑曼不動桿菌和肺炎克雷伯桿菌等引起的嚴重化膿性腦室炎最為嚴重且治療困難［7-8］。本組患者腦脊液mNGS測序和細菌培養呈陽性的致病菌分別為不動桿菌3例（鮑曼不動桿菌2例和皮特不動桿菌1例）、產氣腸桿菌1例，均為革蘭陰性桿菌，可能與此類細菌對抗生素治療不敏感，較易獲得陽性結果有關。而陽性菌感染患者，如果早期合理應用抗生素，可迅速控制病情并使細菌量顯著減少，導致腦脊液細菌培養和mNGS測序均呈陰性。

基因檢測和測序技術目前是多個感染相關學科的研究熱點，但用于神經外科手術后顱內感染的診斷，目前國內尚未見諸報道。理論上，無論細菌存活或死亡均可檢測到DNA片段，故腦脊液mNGS陽性率理論上應該高于細菌培養陽性率，但就本組患者而言，由于臨床檢驗條件的限制，腦脊液基因檢測需外送標本，不能在短時間內進行mNGS測序，這可能是mNGS測序陽性率較低的原因。基因檢測作為一項新的技術，在發現罕見病原體如病毒或罕見細菌、真菌方面具有不可替代的作用［9-10］，但是該技術檢測成本較高、檢測時間較長（24～48小時），對于發病急驟、病情進展迅速的中樞神經系統感染患者而言，影響其時效性［11］，因此，該項技術用于神經外科手術后顱內感染的診治尚待進一步摸索送檢標本方案以提高檢測速度和陽性率，方能更好地服務于臨床，優化治療方案，改善患者預后。

利益沖突無