麝香保心丸下調代謝綜合征大鼠心肌組織尾加壓素Ⅱ及其受體表達的實驗研究

廖叢娟，張旭升， 黃戰軍， 樊小容，譚小青，蔡博治

代謝綜合征(MS)包括高血壓和血脂、血糖及尿酸代謝異常等臨床表現，作為與心血管系統疾病密切相關的多種危險因素，可損傷血管內皮功能、促進動脈粥樣硬化、細胞增殖及膠原沉積等病理過程，最終引起心肌及血管重構發生[1]。MS誘導心肌重構的機制相當復雜，研究發現高血壓導致血流高剪切力、血脂和尿酸代謝異常及胰島素抵抗等作用扮演了重要角色。心肌局部炎癥反應、氧化應激及脂肪細胞因子等活性因子的作用均參與了心肌重構等過程，而血管活性多肽的生物學效應也越來越受到關注[2-4]。尾加壓素Ⅱ(UⅡ)是一種類生長抑制素的血管活性多肽， UⅡ特異受體(UT)為GRP14，屬G蛋白耦聯受體，兩者在心血管組織中均有表達，UⅡ通過結合UT而發揮強烈收縮血管、促進膠原沉積、心肌細胞增殖及血管鈣化等生物學效應[5-6]。因此，防治MS誘導的心肌重構除了控制相應的危險因素，還需要應用針對其分子機制的藥物，麝香保心丸具有抑制炎癥反應及抑制細胞凋亡等作用[7]，本課題組早期研究發現，麝香保心丸可抑制MS誘導的心肌重構[8]，但分子機制未進一步探討，為此，本實驗觀察麝香保心丸對MS大鼠模型心肌重構的變化，同時觀察心肌組織UⅡ/UT表達的變化，探討麝香保心丸的分子作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、藥品及儀器設備 實驗動物為8周齡雄性SD大鼠。鼠尾動脈測壓儀由汕頭大學醫學院實驗動物中心提供，高果糖飼料(60%)由北京華阜康生物科技有限公司配制提供；Beckman Coulter AU5800生化儀購自美國，由汕頭大學醫學院第一附屬醫院檢驗科提供；血糖試紙及快速血糖儀購自美國雅培；UⅡ放射免疫試劑盒由北京華英生物研究所提供；UT一抗(多克隆)購自北京博奧森生物技術有限公司，二抗購自武漢博士德公司；麝香保心丸購自上海和黃藥業有限公司。

1.2 MS大鼠模型建立及分組 取雄性SD大鼠24只，先隨機分成正常對照組(8只)和MS組(16只)，分別用普通飼料和高果糖飼料喂養，8周后檢測大鼠空腹血糖、血清三酰甘油濃度和尾動脈壓，以確定MS模型建立成功。然后再將MS組大鼠隨機分成模型對照組(8只)和麝香保心丸組(8只)， 麝香保心丸組予麝香保心丸25 mg/kg灌胃，每天1次。兩組均繼續高果糖飼料喂養，飼養4周。

1.3 標本收集及處理 3組大鼠均禁食、禁水8 h以上，常規稱重麻醉，剪開胸腔暴露心臟取血，取一部分血置于普通試管，靜置凝固析出血清；一部分血置于含有EDTA和抑肽酶的試管中，低溫離心分離血漿，-80 ℃保存。摘取心臟，稱重后切取部分心肌組織，4%多聚甲醛固定，制作蠟塊，用錫紙包裹其余心肌組織，于-80 ℃保存。

1.4 大鼠空腹血糖、血清三酰甘油和尾動脈壓測定 采用快速血糖儀檢測血糖；采用Beckman Coulter AU5800生化儀檢測血清三酰甘油濃度；采用鼠尾動脈測壓儀測量血壓。

1.5 心肌肥厚指數測定和心肌組織Masson染色 心肌肥厚指數=心臟重量/體重；取大鼠心肌組織蠟塊，制作4 μm厚切片，脫蠟、水化、脫水，滴入Masson復合染色液進行染色(按照說明書操作)，脫水、透明、封片，在光鏡下觀察。

1.6 大鼠血漿和心肌組織UⅡ含量測定 采用放射免疫法測定UⅡ含量，具體步驟按試劑盒說明書操作。

1.7 心肌組織UT表達測定 制作切片，脫蠟入水，5%胎牛血清封閉非特異性抗原，滴加UT一抗(濃度1∶200)過夜，滴加二抗，DAB顯色，具體步驟按說明書進行。

2 結 果

2.1 大鼠MS模型的特點 與正常對照組相比，MS組大鼠血糖、三酰甘油和尾動脈平均壓水平均明顯升高(P<0.01)。詳見表1。

表1 兩組空腹血糖、三酰甘油和尾動脈平均壓水平比較(±s)

2.2 心肌組織膠原染色對比 MS大鼠心肌組織心肌細胞排列紊亂，細胞間質可見明顯膠原沉積，心臟肥厚指數較正常組明顯增加。詳見圖1。

圖1 大鼠心肌組織Masson染色(×40)(藍色為膠原成分)

2.3 大鼠血漿和心肌組織UⅡ含量變化 與正常對照組相比，模型對照組大鼠血漿UⅡ含量差異無統計學意義，心肌組織UⅡ含量、心臟肥厚指數明顯增加，用麝香保心丸干預后，心肌組織中UⅡ含量、心臟肥厚指數有所下降(P<0.01)。詳見表2。

表2 各組大鼠血漿、心肌組織UⅡ含量和心臟肥厚指數比較(±s)

2.4 大鼠心肌組織UT的表達 MS大鼠心肌組織UT表達明顯上調，用麝香保心丸干預后，UT表達有所下調。詳見圖2。

圖2 大鼠心肌組織UT免疫組化染色(×100)(棕黃色為陽性表達)

3 討 論

MS包括高血壓、尿酸及糖脂代謝異常等多種心血管危險因素，這些均可導致血管損傷、細胞增殖、膠原沉積及心肌肥厚等作用，最終導致心血管重構的發生，病理表現在平滑肌細胞、心肌細胞及心肌成纖維細胞等增殖明顯、細胞排列結構紊亂、細胞間質膠原明顯沉積等，主要分子機制包括血管活性因子作用、炎癥反應、脂肪因子效應及氧化應激作用等[1-2，9]。而肥胖是導致MS的重要因素，近年來因生活方式的改變，肥胖人群明顯增多，導致MS發病率升高，因此，防治MS誘導的心肌重構已成為主要治療目標。

本實驗結果顯示，高果糖飼料飼養大鼠8周后可誘導具有典型MS特征的大鼠模型，并且MS大鼠心肌組織出現心肌細胞增殖、排列紊亂，膠原蛋白明顯沉積等，心臟肥厚指數較正常對照組大鼠明顯增加，提示大鼠心肌發生重構，與其他學者研究結果[4]一致。進一步研究發現MS大鼠心肌組織UⅡ/UT表達明顯增加，與心肌重構的程度相關，而3組大鼠血漿UⅡ水平比較差異無統計學意義，提示UⅡ/UT可能通過自分旁分泌的方式參與了MS大鼠心肌重構的過程。

UⅡ是近些年來發現的最強血管收縮物質，UⅡ主要分布在心血管組織、神經組織及內分泌系統，研究發現UⅡ/UT 系統在心血管上的效應主要是引起細胞增殖、遷移，促進心肌細胞膠原蛋白合成，加重心血管重構的發生與發展，與鈣離子、鈣調素、蛋白激酶C、絲裂素活化蛋白激酶及ERK/NF-κB等信號轉導通路相關[10-12]。本研究發現UⅡ/UT在正常生理狀態下在心血管組織的表達很少，但在高血壓、高脂血癥及胰島素抵抗等病理狀態的刺激和誘導下，UⅡ在心血管組織局部大量表達，同時UT表達上調并與UⅡ結合，從而發揮其促心肌細胞增殖、膠原蛋白沉積等生物學效應，結合外周血液UⅡ表達，但差異無統計學意義，考慮UⅡ/UT以自分泌/旁分泌的方式發揮作用可能性較大。

有研究發現，麝香保心丸具有保護血管內皮功能、穩定動脈粥樣硬化斑塊、抑制炎癥反應及血管鈣化[13-15]等作用。本實驗用麝香保心丸干預后，MS大鼠心肌組織UⅡ和UT表達明顯下降，同時心肌組織膠原沉積和心臟肥厚指數有所減輕，提示麝香保心丸可抑制UⅡ/UT表達，改善心肌重構，可能是改善心肌重構的重要分子機制之一，這將為心肌重構的機制研究及防治提供新的思路和作用靶點。