C反應蛋白基因單核苷酸多態性和環境交互作用與缺血性腦卒中的相關性分析

李曉峰，高永俊，崔重林，楊 旭，李新毅，王 征

炎癥反應參與了動脈粥樣硬化的發生及發展進程[1-2]，與缺血性腦卒中(ischemic stroke，IS)的發生及發展密切相關[3]。C反應蛋白(C-reactive protein，CRP)作為一種急性時相炎性蛋白，其血漿濃度與動脈粥樣硬化損傷程度呈正相關[4]。近年來研究報道認為部分CRP基因單核苷酸多態性(Single nucleotide polymorphism，SNP)不僅與血漿水平關聯密切[5-6]，且可增加IS的發生及復發風險[7-9]，但結果頗有爭議[10-11]。IS的發生是由遺傳和環境因素共同作用的疾病，目前公認高血壓病、糖尿病、肥胖、吸煙、飲酒等環境因素與80%的腦卒中發生相關[12]。在這些危險因素中，吸煙、飲酒是血管疾病的主要危險因素[13-15]。然而既往關于CRP與吸煙、飲酒交互作用對腦卒中的影響研究尚少。基于此，本研究擬通過病例-對照研究，根據既往研究陽性結果及HapMap數據庫，篩選CRP基因2個標簽SNP(rs1130864和rs1800947)，探討其基因型、單體型與IS及其亞型發生的相關性，并進一步探討了SNP與環境因素交互作用對IS發生的影響。

1 資料與方法

1.1 研究對象 本研究采用病例對照研究，IS組病人來源于2010年10月—2011年12月連續入住北京大學航天臨床醫學院神經內科病人236例，均為發病3 d內入選，男158例，女78例，年齡(67.14±9.69)歲。診斷依據全國第四屆腦血管病學術會議修訂標準，均經頭顱CT或核磁共振(MRI)證實，并進行TOAST分型[16]，其中大動脈粥樣硬化型腦卒中(large-artery atherosclerosis，LAA)174例，小動脈閉塞性腦卒中或腔隙性腦卒中(small-artery occlusion，SAA)62例。對照組從同期體檢中心選取非IS病人270例，男153例，女117例，年齡(66.79±6.51)歲。排除標準：其他類型腦卒中；近3個月有心、腦及周圍血管疾病史；血液系統疾病、動脈炎、結核、腫瘤、外傷；半個月內有呼吸道、胃腸道等感染史；既往嚴重肝、腎功能疾病或曾接受過器官移植者。

1.2 方法

1.2.1 信息采集 本研究通過本院倫理委員會審查，所有研究對象均簽署知情同意書。采用統一的調查問卷收集臨床資料，包括年齡、性別、身高、體重、冠心病史、糖尿病史、家族史、吸煙史、飲酒史等。

1.2.2 SNP位點篩選 所有研究對象采集清晨空腹靜脈血2 mL，-80 ℃冰箱凍存備用，采用AxyPrep基因組DNA試劑盒提取白細胞基因組DNA。登錄人類HapMap計劃數據庫(http：//hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/)，選擇SNP genotype data下載China Han Beijing(CHB)數據，并運行Haploview3.0軟件(http：//www.broad.mit.edu/mpg/haploview/)，在HapMap Format中讀取CHB數據，設置最小等位基因頻率>0.01，以SNPs之間r2>0.8的原則，選擇CRP基因標簽SNP位點rs1130864與rs1800947。

1.2.3 引物設計及基因分型 采用Premier 5.0進行設計引物(上海英俊生物技術公司)，基因分型采用PCR-RFLP。PCR反應條件：總體積20 μL，含模板DNA10 ng，1.5UTaq酶，dNTP 0.2 mmol/L，2×PCR緩沖液10 μL，兩種引物上下游引物各1 μL。PCR擴增循環條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共25個循環，最后72 ℃延伸7 min。反應結束后，予以3%瓊脂糖凝膠電泳，PCR 擴增結果采用凝膠成像分析系統觀察。PCR產物由限制性內切酶(NEB公司)2 U進行消化，65 ℃溫育1 h，以含溴化乙啶的3%瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切產物。rs1130864擴增段內另有2個酶切位點，測序結果證實此位點發生C>T置換，此次試驗未發現TT基因型。rs1800947經PCR 擴增及酶切后證實發生G>C突變，未發現CC基因型。詳見表1。

1.3 統計學處理 應用SPSS 13.0軟件進行數據分析。IS組和對照組間比較，計數資料采用χ2檢驗或Fisher 精確檢驗，計量資料比較采用t檢驗。兩組間各SNP基因型分布頻率差異采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗。應用多因素Logistic回歸校正相關危險因素，分析每個SNP基因型、等位基因對IS潛在獨立作用，并對基因-環境交互作用進行分析。兩組間單體型分布頻率差異采用unPHASED軟件(Version 3.1.4)。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩組臨床資料比較 除年齡、體質指數(BMI)外，IS組男性、高血壓病、糖尿病、冠心病、家族腦卒中病史、吸煙史、飲酒史率均高于對照組，差異有統計學意義(P<0.01)。詳見表2。

表2 兩組臨床資料比較

2.2 CRP基因SNP與IS及其亞型相關性 對照組rs1130864和rs1800947基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡，提示具備人群代表性。兩組間rs1130864基因型、等位基因頻率分布比較差異無統計學意義(P>0.05)。兩組間rs1800947基因型頻率分布差異有統計學意義[IS組：OR=2.205，95%CI(1.251，3.887)，P=0.005；LAA組：OR=2.178，95%CI(1.189，3.991)，P=0.010；SAA組：OR=2.280，95%CI(1.014，5.127)，P=0.042]。兩組間rs1800947等位基因型分布差異有統計學意義[IS組：OR=2.102，95%CI(1.212，3.645 )，P=0.007；LAA組：OR=2.079，95%CI(1.156，3.739)，P=0.014]。詳見表3。

表3 SNP與IS及其亞型的相關性分析

2.3 兩組間單體型分布頻率分析 據連鎖不平衡系數>0.5為構建單體型標準，CRP基因rs1130864和rs1800947共構建3種單體型：C-G、T-G、C-C。結果發現，兩組單體型C-C頻率分布比較差異有統計學意義[IS組：OR=2.392，95%CI(1.325，4.320)，P=0.007；LAA組：OR=2.355，95%CI(1.260，4.401)，P=0.013]。詳見表4。

表4 CRP單體型與IS及其亞型相關性分析

2.4 基因與環境因素交互作用分析 校正性別(男性)、高血壓病、糖尿病、冠心病、家族腦卒中史后，吸煙病人攜帶rs1800947-GC基因型頻率顯著高于對照組[OR=6.276，95%CI(2.288，17.221)，P<0.001]，飲酒病人攜帶rs1800947-GC基因型頻率高于對照組，差異有統計學意義[OR=9.207，95%CI(2.489，34.056)，P= 0.001]。詳見表5。

表5 CRP基因rs1800947與環境交互作用與IS的相關性分析

3 討 論

研究表明，CRP作為一種急性時相炎性因子，與動脈粥樣硬化乃至IS的發生密切相關[4，17]。血清CRP蛋白水平受遺傳因素的影響[18-19]，Martínez-Calatrava等[20]研究發現CRP基因rs1205、rs1130864、rs1417938、 rs1800947組成的單倍型CCATGCCT和CTATCCTT可解釋2.9%的總血清水平變異。已有證據表明，CRP基因部分SNP可作為IS的獨立危險因素[5-6]。本研究結果顯示，rs1800947基因型頻率分布差異有統計學意義，提示攜帶rs1800947-C等位基因IS組、LAA組的發生風險分別升高2.102倍、2.079倍，這一結果雖與Ladenvall 等[21]、Gonzlez-Giraldo等[10]不同，但與Morita 等[7]結果一致，其團隊發現GC基因型可作為日本老年人群IS發生的獨立危險因素。未發現rs1130864與IS的發生風險有關，與Morita等[7]、Kuhlenbaeumer等[9]研究結果一致，但美國Arenillas等[8]的一項隊列研究結果不同，該研究認為rs1130864-T等位基因可作為IS復發的一個獨立預測因子。本研究分析可能是由于研究方法、地域、種族、樣本量、環境暴露因素等的差異，導致了爭議結果的產生。本研究以rs1130864與rs1800947之間r2>0.8的原則，進行單體型構建，結果顯示IS組單體型C-C頻率顯著高于對照組，提示單體型C-C趨于整體遺傳，且可作為IS的獨立危險因素，與Morita等[7]得出的結論一致，可能是由于共為亞洲人群。盡管本研究并非首例報道CRP基因SNP與IS的相關性研究，但基于既往研究結果不一致，從這項研究中獲得的結果對于理解IS的機制是必要的，特別是對于CRP基因SNP與環境交互作用導致的IS易感性。

IS是由多種基因和環境因素共同作用的結果[22]，推測CRP基因SNP(rs1800947)與環境因素(吸煙、飲酒)在IS發生過程中存在顯著的交互作用。通過多元Logistic回歸發現吸煙者攜帶rs1800947 GC 基因型IS發病率顯著升高，這一結論與Wu等[23]結論相似，其團隊曾采用基因廣義的多因素降維法和多元Logistic回歸，發現CRP基因rs2794521和吸煙存在顯著交互作用，吸煙者攜帶rs2794521-AA基因型較rs2794521-AG或GG基因型IS的發生風險顯著升高。吸煙是動脈粥樣硬化乃至IS的獨立的危險因素之一，其可能損害血管內皮細胞，減少血管舒張因子，上調縮血管物質，并刺激肝細胞合成 CRP，二者可協同促進動脈粥樣硬化及血栓形成[24-25]。同時本研究發現，大量飲酒者攜帶rs1800947-GC基因型IS發病率顯著升高，差異有統計學意義，提示rs1800947-GC基因型與飲酒在IS的發生中存在顯著的交互作用。大量飲酒不僅引發血糖和血脂的代謝紊亂促進動脈硬化的發生發展，還可促進白細胞介素-6(IL-6)釋放，誘導肝臟產生急性時相蛋白CRP，通過改變血液凝固和纖維蛋白溶解等機制而增加 IS 的易患性。

本研究中亦存在一定的局限性。首先，采用病例對照研究，樣本量偏小，不可避免地存在該研究類型局限性，需要謹慎分析結果，尚需進一步進行大樣本前瞻性研究去證實；僅篩選了CRP基因兩個突變頻率較高的SNP，在以后研究中可考慮納入更多的標簽SNP。

rs1130864與IS的發生風險無關，CRP基因rs1800947-GC基因型、單體型C-C與IS的發生風險密切相關，可能是影響IS發生的獨立危險因素。CRP基因rs1800947-GC基因型與吸煙、飲酒存在IS發生過程中顯著的交互作用。