自發性高血壓大鼠發病機制及與血管內皮生長因子和成纖維細胞生長因子關系的實驗研究

劉長召，王 玲，盧新林，陳文江

高血壓是心血管疾病的重要危險因素之一，50%～60%的腦卒中和40%～50%的心肌梗死都與高血壓有關，高血壓患病率呈明顯上升趨勢，目前，我國15歲以上人口的高血壓患病率達24%，估算有2.66億高血壓病人。而值得重視的是，隨著人口老齡化的加速，我國老年高血壓的患病率已經大幅增加，在60～69歲人群中，高血壓患病率超過40%，而且隨著年齡增加患病率逐漸上升，在75歲以上人群中患病率已經超過60%[1-2]。由于老年人的絕對人數和占人口的構成比不斷增長，影響老年人健康長壽和生命質量的主要疾病中，高血壓是一個重要危險因素。高血壓病人往往具有病程長、并發癥多等特點，而且隨著病程發展，會出現心、腦、腎等靶器官損害，其中，以心臟損害最為嚴重，主要表現為左心室心肌肥厚、室間隔肥大、心臟纖維化、心室重構、心室舒張功能障礙及明顯的氧化應激損傷等，晚期往往導致心力衰竭[3-5]。

隨著高血壓的發展，靶器官心臟損害越來越明顯，其發生機制尚不完全明確，目前多認為是多種因素共同導致。其中，心臟的纖維化在靶器官損害中扮演著重要角色，而心臟的纖維化主要認為與多種纖維化因子的紊亂有關，且心臟纖維化與纖維化因子互為因果，互相影響[6-8]。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor，FGF)為心臟較為重要的纖維化因子，現被證實參與心肌梗死后心臟的纖維化過程[9-11]。本研究擬采用自發性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHR)模型，研究高血壓靶器官心臟的損害機制，以期為高血壓治療提供基礎數據和研究方向。

1 材料與方法

1.1 動物模型與標本采集 20只雄性SHR(6月齡)，分為兩組：SHR模型組及給予氨氯地平(購于上海通用藥業公司)10 mg/(kg·d)喂養的模型對照組(氨氯地平模對照組)，每組10只；另取10只Wistar-Kyoto rats(WKY)作為WKY正常對照組，皆由廣東省實驗動物中心提供。將3組大鼠喂養12周，SHR模型組與WKY正常對照組大鼠給予正常標準飼料喂養，而氨氯地平模型對照組SHR則在標準飼料中混入氨氯地平進行喂養。實驗周期為12周，每周測1次大鼠血壓(用鼠尾靜脈血壓儀進行測量)和體重。于實驗結束時，先采集各組大鼠右心室血液2 mL，然后獲取大鼠心臟組織。

1.2 試劑與儀器 VEGF和FGF ELISA試劑盒由深圳柏萬森生物有限公司提供，核酸蛋白測量儀(Biophotometer，Eppendorf公司)，PCR擴增儀(Eppendorf公司，德國)，LightCycler480II全自動熒光定量PCR儀(羅氏，瑞士)，全自動酶標議(BIO-RAD，美國)，穩流穩壓電泳儀(BIO-RAD，美國)，垂直電泳槽(BIO-RAD，美國)，電轉膜儀(BIO-RAD，美國)，逆轉錄試劑盒(寶生物工程大連有限公司)，PCR試劑盒(寶生物工程大連有限公司 )，TRIZOL試劑(Invitrogen，美國)，PCR引物(英濰捷基上海貿易有限公司合成)，VEGF和FGF抗體(武漢博士德生物試劑公司)，Western及IP細胞裂解液(碧云天生物技術研究所)，PMSF(碧云天生物技術研究所)，增強型BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術研究所)。

1.3 ELISA檢測血漿VEGF和FGF 將所獲取的各組大鼠全血進行離心(3 000 r/min，24 ℃，10 min)分離血漿，取各組大鼠血漿，按照ELISA試劑盒說明書對血漿VEGF和FGF進行檢測，觀察其變化情況。具體步驟按照試劑盒說明書進行。

1.4 qRT-PCR提取大鼠心臟組織RNA 首先應用TRIZOL按照說明書提取所獲取各組大鼠心臟組織的RNA，最后所得RNA吸光度值A260/A280在1.7～2.1為合格。按照逆轉錄試劑盒說明書將所提取RNA進行逆轉錄，然后將逆轉錄所獲取的cDNA模板按照實時熒光定量PCR試劑盒說明書進行熒光定量，其中，預變性30 s，95 ℃；擴增、延伸15 s，95 ℃；退火30 s，60 ℃，共40個循環，以β-actin作為內參。VEGF引物：上游TCCAATTGAGACCCTGGTGGA，下游AAGGCTCACAGTGAACGCTCC；FGF引物：上游AACACTTACCGGTCACGGAA，下游CAGGGTGGCTAGGCTACTACT；β-actin引物，上游GCAGGAGTACGATGAGTCCG，下游ACGCAGCTCAGTAACAGTCC。本研究采用2-ΔCt相對定量方法進行數據分析：ΔCt(實驗組)=Ct(實驗組目標基因)-Ct(實驗組內參基因)；ΔCt(對照組)=Ct(對照組目標基因)-Ct(對照組內參)。

1.5 用Western Blot檢測大鼠心臟組織VEGF和FGF蛋白表達 將所獲取的各組大鼠心臟組織左心室進行分離，提取蛋白質，采用BCA法測量蛋白濃度，繼而進行蛋白電泳、轉膜、VEGF和FGF一抗孵育、二抗孵育、雜交、顯影、曝光。VEGF稀釋比例1∶1 000，FGF稀釋比例1∶1 000，內參選用β-actin(稀釋比例1∶1 000)。結果分析用Image J圖像分析軟件計算條帶灰度值，最后結果為目的條帶灰度值/內參條帶灰度值。

2 結 果

2.1 各組大鼠血壓情況 3組大鼠在實驗期間生長良好，SHR模型組死亡1只，另外兩組未見死亡。 SHR在進行氨氯地平喂養后，血壓可以明顯下降，與SHR模型組比較差異有統計學意義(P<0.05)，而在12周時與WKY正常對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。說明氨氯地平可有效降低SHR血壓。詳見表1。

表1 各組大鼠不同時間收縮壓情況比較(±s) 單位：mmHg

2.2 各組大鼠血漿VEGF和FGF表達情況 3組大鼠血漿ELISA檢測結果發現，SHR模型組血漿VEGF和FGF的表達較WKY正常對照組和氨氯地平模型對照組升高(P<0.05)，氨氯地平模型對照組血漿VEGF和FGF的表達明顯降低(P<0.05)，然而仍然高于WKY正常對照組(P<0.05)。詳見表2。說明VEGF和FGF與SHR高血壓的發生有關。

表2 各組大鼠血漿VEGF和FGF的ELISA檢測情況比較(±s) 單位：ng/L

2.3 各組大鼠心臟組織VEGF和FGF mRNA表達情況 提取3組大鼠心臟組織RNA，進行逆轉錄和熒光定量檢測，發現SHR模型組心臟組織VEGF和FGFmRNA表達較氨氯地平模型對照組與WKY正常對照組明顯增加(P<0.05)，而氨氯地平模型對照組則與WKY正常對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。詳見圖1。說明VEGF和FGF在SHR大鼠的心臟靶器官損害中起著重要作用，且隨著藥物的應用，高血壓進程不再惡化，基因的表達差異無統計學意義。

與SHR模型組比較，＊P<0.05。

2.4 各組大鼠心臟組織VEGF和FGF 蛋白表達情況 SHR模型組VEGF和FGF蛋白表達較氨氯地平模型對照組與WKY正常對照組的表達明顯增加(P<0.05)，而氨氯地平模型對照組則與WKY正常對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。詳見圖2、圖3。說明SHR高血壓的發生發展可能與VEGF和FGF有關。

圖2 各組大鼠心臟組織VEGF和FGF蛋白表達情況(電泳圖)(A為 WKY正常對照組；B為 SHR模型組；C為氨氯地平模型對照組)

與SHR模型組比較，＊P<0.05。

3 討 論

目前我國老年高血壓病人已達8 346萬人，而且老年高血壓患病人數呈持續增加趨勢，隨著年齡增加患病率逐漸上升，75歲以上人群患病率已經超過60%；老年高血壓發病率在男女性別間不同，60歲以上男性發病率為41.6%，而女性為38.4%。由于老年人的絕對人數和占人口的構成比在不斷增長，高血壓已經嚴重影響老年人的健康和生命質量，成為嚴重危害健康的心血管疾病[12-13]。高血壓發病機制目前主要認為與遺傳因素(主要有單基因遺傳模式和多基因遺傳模式，其中多基因遺傳模式是主要的一種，而單基因遺傳模式只存在于少數高血壓病人中)、大動脈彈性減退(動脈發生粥樣硬化和纖維性硬化)、周圍血管阻力升高、腎臟排鈉能力下降、交感神經系統α受體功能亢進、血小板功能減退、壓力感受器功能下降等機制有關[3，14]。高血壓對人體的損傷主要通過靶器官心、腦、腎、眼底等來實現，尤其對心臟的損害較為常見，往往導致心室肥厚、心肌纖維化等，而目前研究表明高血壓病理生理過程與VEGF、FGF等因子密切相關。

VEGF也稱血管通透因子(vascular permeability factor，VPF) 或者促血管因子(vasculotropin，VAS)，其作用是能夠特異性地直接作用于血管內皮細胞，可以刺激血管內皮細胞增殖、遷徙，甚至改變其基因表達，是促進血管生成的重要因子[9，15-18]。有研究證實原發性高血壓病人的血漿VEGF水平正較常人明顯升高[8，19]；另有研究證實VEGF隨著原發性高血壓的發展而在心肌細胞中的表達逐漸增強[20-21]。FGF是一種能調節細胞增殖、分化的多肽家族，在體內的許多組織和器官內均有分布，其作用主要是促進內皮細胞的游走和平滑肌細胞的增殖，但是不能使平滑肌細胞游走；同時能夠促進新血管形成，修復損害的內皮細胞[7，10，14]。有研究證實FGF與高血壓的發生發展有密切關系，并導致心室肥厚[2，11，18]。

本研究通過SHR動物模型，以WKY作為對照，并采用氨氯地平進行治療，研究高血壓靶器官心臟的損害機制，通過對VEGF和FGF在3組大鼠血漿水平和心臟組織基因和蛋白水平的檢測發現，SHR中VEGF和FGF無論在血漿蛋白還基因和組織蛋白水平較氨氯地平模型對照組與WKY正常對照組的表達明顯增加，而氨氯地平模型對照組則與WKY正常對照組比較差異無統計學意義，說明VEGF和FGF參與了SHR靶器官心臟損害，可能在高血壓的發展中起著重要作用。

本研究通過SHR模型探討VEGF和FGF對高血壓發病機制的影響，在動物模型和分子生物學層面進行探討，結果表明VEGF和FGF在SHR表達明顯升高，經過氨氯地平處理后會相應下降，說明VEGF和FGF與高血壓發病機制密切相關，可為高血壓的靶向及基因治療等提供新思路和新方法。由于本研究是動物模型研究，有可能導致結果與臨床有差異，且本研究只是一個初步研究，對于VEGF和FGF的具體機制未進行信號通路阻斷及上下游基因探討，有待繼續深入研究以探明VEGF和FGF在高血壓中的確切作用機制。