FOXO3a蛋白對腦缺血損傷大鼠細胞自噬的影響研究

周乃強，姚楊玲，黃堅毅

缺血性腦損傷屬于腦血液循環障礙性疾病[1]。一般臨床表現為運動障礙如偏癱以及言語不清等，有些還會造成智力障礙[2]。FOXO3a蛋白可以調控細胞內部環境的穩定，B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)與Bax是相互對立的一對基因，與細胞凋亡之間有密切關聯，對神經系統有重要作用。本研究通過檢測腦缺血性大鼠FOXO3a蛋白、Bcl-2蛋白及Bax蛋白表達水平，探究其在腦缺血性大鼠中的水平變化及對大鼠神經功能和細胞自噬的影響。

1 材料與方法

1.1 研究動物與分組 選取20只Wistar大鼠，由廣西大學動物科學技術學院提供，雌雄不限，月齡3～6(3.8±1.5)個月，體質量200～250(220±8)g。所有大鼠均養殖在清潔籠子里，室溫(25.5±3.8)℃，相對濕度40%～45%，每天光照12 h，喂飲純凈水。經過1周飼養時間后，隨機分為正常組和腦缺血組，其中正常組10只，腦缺血組10只。本實驗獲得我院實驗動物倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 大鼠腦缺血模型的建立 采取四動脈結扎法，參照杜郭佳等[3]的方法，并作出適當改進，腦缺血組大鼠均用10%的水合氯醛進行腹腔麻醉，以俯臥體位固定在立體定向儀上，將頭頂部毛發剃除并消毒后，使用高頻電刀在第一頸椎橫突翼的左右橫突孔永久性阻斷椎動脈血流，1 d后，使用動脈夾將大鼠兩側的頸總動脈夾閉，5 min后打開動脈夾，實驗結束。實驗后大鼠出現意識混亂、瞳孔散大、呼吸加快、無痛感以及瞳孔對光反射消失等，說明腦缺血大鼠模型建造成功，大鼠實驗過程中死亡(2只)以及實驗結束后造模不成功者棄用。

1.2.2 標本采集 將待測大鼠用乙醚麻醉后，斷頭處死，切取腦組織70 mg，加入10倍體積的離心緩沖液，手動勻槳10 min，用離心機以2 000 r/min的轉速分離，取上層血漿電動勻漿后，用離心機以3 000 r/min的轉速分離，取上層血漿放置-50 ℃冰柜中凍存。

1.2.3 免疫組化法檢測FOXO3a蛋白、Bax蛋白及Bcl-2蛋白 加入二甲苯和乙醇進行脫蠟處理，加入枸櫞酸緩沖液進行切片抗原熱修復，0.3% H2O2殺死過氧化物酶的活性，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)緩沖液清洗3～5次，待切片干燥加入稀釋一定比例的一抗，在37 ℃的環境中培養1～2 h，之后再次使用PBS緩沖液清洗3～5次，使用DAB顯色試劑盒顯色3～5 min。通過比色達到檢測FOXO3a蛋白、Bax蛋白及Bcl-2蛋白的目的。

1.2.4 雙盲法測定神經功能評分 采用雙盲法對大鼠手術后1 d、2 d、3 d進行轉角實驗。把大鼠放在30°的夾角里，觀察大鼠往哪個方向轉移，記錄其轉向，向左或是向右，每次實驗重復10次，每次實驗間隔大于15 s。評定神經功能評分，神經功能評分=右轉次數/總次數×100%。

1.2.5 Western Blot檢測細胞自噬相關蛋白Beclin-1、LC3細胞自噬功能的改變 將凍存標本通過SDS-PAGE凝膠進行電泳，將適量濃縮的SDS-PAGE蛋白緩沖液加入，靜置15 min；在100 V的環境中電泳10 min，電泳結束后，將電轉膜放置封閉在37 ℃環境中的搖床上，然后加入10%的牛奶，持續1.5 h；加入一抗，加入TBST稀釋按(1∶1 000)稀釋一抗，在4 ℃的環境下，經過孵育后過夜保存；第2天用TBST緩沖液清洗，在室溫中與二抗結合，孵育1 h。再次用TBST緩沖液清洗，最后將其浸泡在底物溶液中進行顯色，采用BCA蛋白定量試劑盒，分析灰度值，目的蛋白條帶灰度值/內參條帶灰度值=目的蛋白相對表達量，達到檢測細胞自噬的目的。

1.2.6 倒置熒光顯微鏡下觀察細胞自噬 用5%水合氯醛溶液將大鼠麻醉，固定，注入4%多聚甲醛PBS緩沖液150 mL，斷頭取腦，將腦組織存于4%多聚甲醛固定液中，包埋、切片、脫蠟，進行熒光染色。用倒置熒光顯微鏡下觀察細胞自噬現象的產生，細胞內出現大量自噬熒光顆粒，這些現象提示可能有自噬發生。

2 結 果

2.1 正常組和腦缺血組大鼠FOXO3a蛋白表達比較 腦缺血組大鼠FOXO3a蛋白表達明顯高于正常組，差異有統計學意義(P<0.05)。詳見表1、圖1。

表1 兩組大鼠FOXO3a蛋白表達比較(±s)

圖1 FOXO3a蛋白免疫組化圖(×100)

2.2 正常組和腦缺血組促細胞凋亡Bax蛋白及Bcl-2蛋白水平 腦缺血組大鼠Bax蛋白表達水平高于正常組Bax蛋白表達水平(P<0.05)；腦缺血組大鼠Bcl-2蛋白表達水平明顯低于正常組Bcl-2蛋白表達水平，差異有統計學意義(P<0.05)。詳見表2、圖2。

表2 兩組大鼠Bax蛋白及Bcl-2蛋白比較(±s) 單位：pg/mL

圖2 Bax蛋白及Bcl-2蛋白免疫組化圖(×100)(A為正常組Bax；B為腦缺血組Bax；C為正常組Bcl-2；D為腦缺血組Bcl-2)

2.3 正常組和腦缺血組神經功能評分比較 腦缺血組神經功能評分高于正常組，差異具有統計學意義(P<0.05)。詳見表3。

表3 兩組大鼠神經功能評分比較(±s) 單位： 分

2.4 正常組和腦缺血組細胞自噬相關蛋白情況比較 腦缺血組細胞自噬相關蛋白Beclin-1、LC3及細胞自噬率高于正常組，差異有統計學意義(P<0.05)。詳見表4、圖3。腦缺血組大量熒光顆粒顯著多于正常組。在倒置熒光顯微鏡下觀察到細胞內出現大量自噬熒光顆粒，這些現象提示可能有自噬發生。詳見圖4。

表4 兩組大鼠細胞自噬相關蛋白比較(±s)

圖3 Beclin-1、LC3細胞自噬率電泳圖

圖4 倒置熒光顯微鏡下細胞自噬觀察(×400)

3 討 論

腦卒中屬于神經科疾病，臨床病死率高達40%～50%。腦血管病變是其最為主要的發病原因，高血壓、高血糖、高血脂等都與腦缺血有密切關系[4]。腦卒中病人大多是在安靜狀態下突發起病，突然發生的局灶性神經功能缺失癥候群，損傷的癥狀符合血管分布區特點，幸存病人中大多留有不同程度的后遺癥[5]，如運動型障礙、認知型障礙、言語型障礙等后遺癥，這些都極大程度地危害病人身心健康，對病人生活及生存質量均造成巨大威脅[6]。

FOXO3a蛋白可以抑制細胞增殖、促進細胞凋亡、增強抗氧化應激能力，調控細胞內環境的穩定，在細胞衰老的過程中發揮著至關重要的作用[7]。癌癥中常見FOXO3a基因下調，腫瘤發生會造成FOXO3a在機體內的異常表達，有著密切關聯，所以FOXO3被稱為腫瘤抑制器。腦缺血會造成FOXO3a蛋白表達異常，從而導致細胞凋亡[8]。Bcl-2是重要的癌癥基因，對細胞凋亡具有抑制作用，可以抑制多種細胞毒作用造成的細胞凋亡。細胞凋亡需要信號傳導，存在一個共同的通路途徑，這一途徑主要是依靠Bcl-2控制[9]。DNA損傷之后需要依靠p53蛋白分子起傳導或媒介作用，而Bcl-2抑制p53媒介凋零死亡，但是不能使p53媒介停止生長。Bax蛋白屬于兔抗人單克隆體，是Bcl-2家族里促細胞凋亡基因。Bax蛋白會在線粒體膜上形成同源二聚體，使細胞內鈣含量過高，誘導各種酶的激活，促使細胞凋亡。Bcl-2與Bax是相互對立的一對基因，高水平的Bcl-2可以使細胞對凋亡的抵抗力增強[10]。本研究發現，腦缺血大鼠體內Bcl-2與Bax水平均存在異常表達，對機體內細胞的生存環境造成嚴重影響，從而致使細胞發生自噬反應。

神經系統是人體內對生理功能調節的主要系統[11]，由神經組織組成，分為中樞神經及周圍神經系統，包括腦和脊髓、腦神經和脊神經。人體內的結構和功能相當錯綜復雜，各個器官的生理過程都不是獨立完成的，是在神經系統的調配控制下，相互聯系、影響及配合中完成的[12]。在神經系統的調配下，人體才是一個完整統一的有機體。腦缺血病人最初神經功能受損程度會持續升高，待達到頂峰后會有明顯的好轉，但最終腦缺血會對病人神經系統造成巨大影響及損壞。楊靖等[13]在研究中表明，大鼠腦缺血會對大鼠神經系統造成嚴重損傷，與本研究結果一致，但其研究中腦缺血大鼠神經功能評分為(78.2±3.6)分，低于本研究中腦缺血大鼠神經功能評分，可能與研究所選取大鼠種類有關，本研究所選取大鼠為Wistar大鼠，Wistar大鼠是動物實驗大鼠類最為常用及生物醫學研究中使用歷史最長的品種，廣泛應用于生物醫學各領域的實驗。

細胞自噬是形成雙層膜的自噬泡，將細胞質內的物質包裹起來，然后通過溶酶體融合并消化掉的過程。細胞自噬只是細胞在高脅迫的環境中細胞自行采取的一種應急機制，目的是在為自身提供營養或者降解掉錯誤折疊蛋白等，細胞的自噬并不一定會引起細胞死亡。中性粒細胞與細胞的吞噬和消化功能有關[14]。細胞自噬在中樞神經系統中具有重要的參與意義，主要發揮維持神經元功能作用。LC3是酵母自噬相關基因8，主要存在于哺乳動物中，是自噬體膜特異性重要組成部分。Beclin-1是哺乳動物酵母自噬相關基因6，在自噬體形成過程中發揮著重要作用，具有自噬激活象征。腦缺血-缺氧會引起LC3重新分布。

本研究顯示，腦缺血組細胞自噬相關蛋白Beclin-1、LC3自噬率較高。在倒置熒光顯微鏡下觀察到細胞內出現大量自噬熒光顆粒，這些現象說明可能有自噬發生。此與田雨等[15]研究結果保持一致。

綜上所述，FOXO3a蛋白在腦缺血損傷中高表達，Bax蛋白在腦缺血損傷中高表達，Bcl-2蛋白在腦缺血損傷中低表達，腦缺血會對神經功能造成損傷，并提高細胞自噬率。FOXO3a蛋白、Bax蛋白、Bcl-2蛋白對腦缺血病人的治療及預后有重要意義。