惡性膠質瘤U87細胞中miR-147啟動子區甲基化程度對miR-147表達及細胞增殖的影響

武偉男，許小斌，連世忠

基因啟動子區高度甲基化可以關閉某些基因尤其是抑癌基因的活性，導致基因表達受限，表達量降低，從而影響細胞的增殖[1-3]。一些研究發現，微小RNA-147(miR-147)在肺癌、卵巢癌等腫瘤組織中可以抑制腫瘤細胞的增殖，起抑癌基因的作用[4-6]。而目前及既往研究中并未提及miR-147啟動子區甲基化在膠質瘤研究中的相關報道，本實驗應用惡性膠質瘤細胞U87細胞模擬人體膠質瘤組織，探究U87細胞中miR-147基因啟動子區甲基化程度與miR-147表達量及細胞增殖的關系，為膠質瘤的診斷以及治療提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 U87細胞(北京協和醫學院基礎所細胞中心)；DMEE高糖培養基、無菌磷酸緩沖鹽溶液(PBS)溶液等；雙抗；潔凈工作臺(江蘇蘇潔凈化設備廠)；低速低溫離心機、移液器(Eppendorf)；PCR儀、測序儀(美國ABI)；電泳儀、電泳槽(北京六一儀器廠)；冷凍離心機(安徽中科中佳科學儀器有限公司)；臺式高速離心機(湖南湘儀實驗儀器開發有限公司)；凝膠成像儀微型旋渦混合儀(上海滬西分析儀器廠有限公司)；數顯恒溫水浴鍋(太倉市科教器材廠)；BP系列精密單道可調移液器(加拿大BBI)；UV-Vis Spectrophotometer(Merinton)；冰箱(青島海爾股份有限公司)。其余試劑以及所用儀器均購置于上海生工股份有限公司。

1.2 配制不同濃度5′aza-dC DMEM高糖培養基 首先配制成濃度為1 mmol/L的儲存濃度，然后分別用DMEM高糖培養基稀釋，稀釋后使其濃度分別為4 μmol/L、16 μmol/L備用。

1.3 細胞培養 培養基組成：DMEM、PBS以及雙抗；培養條件：5%二氧化碳(CO2) 、37 ℃溫培養箱。設置空白組與實驗組，空白組用一般高糖培養基培養，實驗組分別使用不同濃度5′aza-dC DMEM高糖培養基培養，并作為4 μmol/L組、16 μmol/L組，每組均設置3個復孔。實驗過程中注意無菌操作，并且及時換液以保證細胞活性。

1.4 檢測方法

1.4.1 使用BSP法檢測U87細胞中miR-147啟動子區甲基化程度 細胞培養24 h后，使用Ezup 柱式動物組織基因組DNA抽屜試劑盒提取各組細胞中的目的DNA，對提取的DNA使用亞硫酸氫鈉修飾。BSP引物序列如下：上游引物序列為5′-ATAGTGGTGTAATTTTGGTTTATTG-3′，下游引物序列為3′ -CCCAACACTTTAAAAAACTAAAAC-5′，擴增序列為198bp(包括引物序列)。本次實驗反應體系：總體積為64 μL，其中cDNA 1.5 μL，上下游引物各2 μL，dNTP(mix) 3 μL，Taq Buffer (with MgCl2) 5 μL，Taq酶 0.5 μL，dd H2O 50 μL。本次實驗反應條件：95 ℃ 4 min，94 ℃ 30 s，55 ℃～60 ℃ 25 s，72 ℃ 40 s，35個循環，72 ℃ 6 min。PCR產物取5 μL進行電泳，即1%瓊脂糖凝膠電泳，根據電泳圖觀察結果。亞硫酸氫鹽修飾后測序所得圖譜使用Chromas軟件進行分析。各組中每個位點做5次克隆，重復2次，共10次克隆，記錄每個位點發生甲基化的情況，計算各位點的甲基化率及各組總甲基化率。

1.4.2 QPCR技術檢測各組細胞中miR-147表達量 繼續細胞培養48 h后，檢測各組細胞中miR-147表達量。首先通過Trizol試劑提取總RNA，然后在反轉錄試劑引導下進行RNA的反轉錄獲得cDNA第一鏈，最后以單鏈cDNA 為PCR模板 ，在對應引物的引導下，以U6為內參，進行miR-147表達量的QPCR檢測。檢測引物序列miR-147-上游：5′-GGGGTGTGTGGAAAT-3′和miR-147-下游：3′ -AACTGGTGTCGTGGAGTCGGC-5′，U6-上游：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′和U6-下游：3′ -AACGCTTCACGAATTTGCGT-5′。反應程序：95 ℃，3 min；95 ℃，5 s；56 ℃，10 s；72 ℃，25 s；39 cycles；65 ℃，5 s；95 ℃，50 s。miR-147的表達量采用Ct比較法進行計算。每個復孔檢測3次。

1.4.3 觀察細胞數目及受抑制程度 顯微鏡下觀察，記錄細胞數目并計算細胞受抑制程度，細胞受抑制程度=[(空白組細胞數-實驗組細胞數)/空白組細胞數]×100%。

2 結 果

2.1 目的基因序列與亞硫酸氫鹽修飾后模式序列(見圖1) 亞硫酸氫鈉處理后模式序列：所有C轉為T，CG位點仍然為C。方框內為設計引物的位置。該基因片段共有9個CG位點(見圖1中紅色標記)。將這些位點分別記作1～9。

圖1 目的基因序列與亞硫酸氫鹽修飾后模式序列(A為目的基因序列；B為修飾后模式序列)

2.2 各組電泳結果(見圖2) 以下結果是取5 μL PCR產物進行電泳，電泳參數：150 V，100 mA所得的DNA Marker，分別是空白組(0 μmol/L)、4 μmol/L組以及16 μmo/L組，每條條帶的核苷酸序列長度約為198 bp。

2.3 測序結果(見圖3) 發生甲基化的CG位點保持不變，未發生甲基化的CG位點C堿基則變為T堿基。

圖2 各組電泳結果

圖3 測序結果

2.4 測序后各組miR-147啟動子區甲基化率(見圖4) 空白組各位點甲基化率分別為100%、40%、40%、20%、60%；4 μmol/L組各位點甲基化率分別為100%、40%、20%；16 μmol/L組各位點甲基化率分別為40%、20%。計算總甲基化率：空白組為14.6%，4 μmol/L組為8.9%，16 μmol/L組為3.4%。

圖4 測序后各組miR-147啟動子區甲基化率(A為空白組；B為4 μmol/L組；C為16 μmol/L組)

2.5 不同組中miR-147表達量比較及細胞抑制率(見圖5、圖6) 空白組miR-147相對表達量為0.29±0.02，4 μmol/L組miR-147相對表達量為0.66±0.03，16 μmol/L組miR-147相對表達量為1.09±0.05。組間比較采用單因素方差分析，差異有統計學意義(P<0.001)。4 μmol/L組大約有19.4%細胞受抑制，16 μmol/L組大約有51.6%細胞受抑制。

圖5 各組中miR-147相對表達量

圖6 各組培養72 h后細胞數目切片圖

3 討 論

膠質瘤是神經外科常見的一類腫瘤，在顱內腫瘤中占比非常高，其發生率占顱內腫瘤的40%～50%[7-9]，其治療相當困難，尤其是膠質母細胞瘤[10]，即使積極通過手術、放化療等措施，其生存周期也往往不足1年。而臨床治療膠質瘤的化療藥物主要是去甲基化藥物替莫唑胺[11-13]，其主要作用為抑制MGMT基因啟動子區甲基化程度。但是有些膠質瘤已經對替莫唑胺的去甲基化作用產生耐藥性[14-16]。所以，需要尋找更為合適的方法來攻克這一難題，目前，研究基因啟動子區甲基化是一個比較熱門的方向。

基因啟動子區甲基化廣泛存在于包括人類在內的哺乳動物體內[17]，尤其與某些腫瘤的發生發展相關[18-19]。研究基因啟動子區甲基化主要是研究啟動子區的CpG島中CG位點的甲基化情況，如果CpG島中甲基化程度過高，則會抑制該基因的表達，相反，如果降低啟動子區的甲基化程度，則會使該基因表達恢復，這就是DNA啟動子區甲基化的“開關”現象[10]。

本實驗通過使用不同濃度的甲基化轉移酶抑制劑5′aza-dC培養基培養U87細胞，使該細胞中miR-147啟動子區甲基化水平發生不同程度的降低，并且檢測各組中miR-147的表達量及細胞抑制率。根據實驗結果，發現降低U87細胞中miR-147啟動子區甲基化程度后會使miR-147的表達量增多，并且能夠抑制細胞增殖。因此，這可能為去甲基化藥物的研究提供一個新的作用位點，通過降低miR-147啟動子區甲基化程度來達到治療膠質瘤的目的，當然，這確切機制仍需要在人腦膠質瘤組織以及其他膠質瘤細胞系中做進一步的研究，并進行相關的動物實驗研究。