泛素羧基末端水解酶1 基因缺失對雌性小鼠生殖系統發育的影響

吳 比，梁珊珊，阮井玲，黃 鑫，滕曉明，洪 嶺

(同濟大學附屬第一婦嬰保健院輔助生殖科，上海 200001)

泛素羧基末端水解酶（ubiquitin C-terminal hydrolase，UCH）是去泛素化家族中的重要成員[1]，其主要功能是將泛素羧基端連接小肽或酯類分子水解下來。UCH-L1具有去泛素化作用、泛素連接酶活性和穩定細胞內泛素單體的功能，參與泛素介導的蛋白質降解途徑，在神經系統[2-3]、生殖系統[4-5]、腫瘤發生和轉移[6]，以及腫瘤細胞增殖[7]過程中發揮重要作用。

已有研究證實，UCH-L1 參與卵子發生[5]。在魚類的卵巢組織中，UCH-L1 主要表達于卵巢的卵黃上；在發育和滯育的卵黃中UCH-L1 表達水平較高，而在成熟細胞的卵黃中幾乎檢測不到UCH-L1，由此推測UCH-L1與卵黃的發生存在密切關系[8]。UCH-L1 在哺乳動物卵母細胞中高表達[5,9]，與卵母細胞皮質和減數分裂紡錘體相關聯[10]。抑制UCH-L1 的作用后，豬卵母細胞停滯在第1次減數分裂中-后期過渡點[11]。在卵母細胞成熟過程中，向小鼠的生發泡（germinal vesicle，GV）期卵母細胞中注入UCH 家族酶活性抑制劑泛素-醛（ubiquitin aldehyde，UBAL）后，引起紡錘體和第一極體發育異常，導致其減數分裂停滯在減數分裂Ⅰ（meiosis Ⅰ, MⅠ）期，提示UCH-L1通過調節皮質和減數分裂期紡錘體來影響卵母細胞的成熟[12]。

本研究擬利用現有的UCH-L1 基因缺失小鼠模型，觀察其卵巢功能和卵泡發育等生殖相關表型，以期建立一種新的生殖功能障礙小鼠模型，并為研究UCH-L1分子途徑在卵泡發育中的作用機制提供必要工具。

1 材料與方法

1.1 UCH-L1 基因缺失小鼠的繁殖、飼養

SPF 級8 周齡的UCH-L1 基因缺失雜合子（UC H-L1＋/－）小鼠（3♂∶2♀）由軍事醫學科學院衛生學環境醫學研究所劉曉華實驗室贈送[品系名為B6;129P2-UCH-L1tm1Dgen /Mmnc，來自美國突變小鼠區域性資源中心（Mutant Mouse Regional Resource Centers，MMRRC）]。SPF 級8 周齡野生型（UCH-L1＋/＋）C57BL/6J 雌性小鼠購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司[SCXK（滬）-2018-0006]。所有小鼠都飼養于同濟大學實驗動物房[SYXK（滬）-2020-0002]層流架中，分籠飼養，喂食轉基因動物專用鼠糧[江蘇省協同醫藥生物工程有限公司，蘇飼證（2019）01008）]，自由飲水，室溫22～25 ℃，相對濕度為（50 ±10）%，每天14 h 光照，適應性飼養1 周。為了保種和獲得UCH-L1 基因缺失純合子（UCH-L1－/－）小鼠，安排3個合籠：（1）1 ♂UCH-L1＋/－與2 ♀UCH-L1＋/－合籠；（2）1 ♂UCH-L1＋/－與2 ♀UCH-L1＋/＋（野生型）合籠；（3）1 ♂UCH-L1＋/－與2 ♀UCHL1＋/＋合籠。

1.2 UCH-L1 基因缺失子代小鼠的基因型鑒定

幼鼠出生3 周后與母鼠分離，取約0.5 cm尾尖組織，提取小鼠基因組DNA，采用PCR 法鑒定UCH-L1 基因缺失。PCR 引物1 序列為5'-CCTTGCCTCCGTCCTCTATTAAAGC-3'，引物2序列為5'-GGGTGGGATTAGATAAATGCCTGCTCT-3'，引物3 序列為5'-CTCTCCCCAGACTTAAGCTGCTTTG-3’。PCR 反應的退火溫度為58 ℃。目的基因片段大小分別為447 bp 和213 bp。其中，僅出現1個大小為213 bp 的條帶（引物1 和3 擴增獲得）時判定為野生型（UCH-L1＋/＋），僅出現1 條大小為447 bp 的條帶（引物2 和3 擴增獲得）時判定為純合型（UCH-L1－/－），出現2 條大小分別為447 bp 和213 bp 的條帶時判定為雜合型（UCH-L1＋/－）。

1.3 UCH-L1 基因缺失雌性小鼠繁殖性能的檢測

將得到的雜合型（UCH-L1＋/－）和純合型（UCH-L1－/－）雌性小鼠飼養到12 周，通過陰道涂片和吉姆薩染色的方法檢測其發情周期；之后與性成熟的野生型（UCH-L1＋/＋）雄性小鼠按照1 ∶2 的比例合籠，測定其繁殖性能。

1.4 蘇木精-伊紅染色觀察卵巢及卵泡形態

取12 周齡的野生型（UCH-L1＋/＋）、雜合型（UCH-L1＋/－）和純合型（UCH-L1－/－）雌性小鼠各2 只，麻醉過量致死后收集卵巢組織，進行固定、包埋和切片。取卵巢最大縱切面的蠟片，脫蠟后進行蘇木精和伊紅染色，最后脫水封固。光學顯微鏡下觀察卵巢中卵泡的大小、形態和分類。

1.5 免疫組織化學法檢測卵巢組織中關鍵激素受體的表達

將1.4 節中獲得的卵巢組織切片，采用免疫組織化學法檢測雌激素受體β（estrogen receptorβ，ER-β）、卵泡刺激素受體（follicle-stimulating hormone receptor，FSHR）、黃體生成素受體（luteinizing hormone receptor，LHR）及孕酮受體A（progesterone receptor-A，PR-A）和UCHL1 的蛋白表達情況，其中一抗包括兔抗FSHR 和LHR 多克隆抗體（稀釋比例均為1∶50）購自武漢博士德生物工程有限公司，鼠抗ER-β 單克隆抗體（1 ∶150）和兔抗PR-A 單克隆抗體（1∶100）購自英國Abcam 公司，兔抗UCHL1多克隆抗體（1∶200）購自美國Invitrogen 或Thermo Fisher Scientific 公司。卵巢組織切片經抗原修復、山羊血清封閉后，加入一抗，4 ℃反應過夜；PBS 洗3次，加入生物素化二抗，37 ℃孵育45 min；PBS 洗3次，加入辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素-生物素復合物三抗，37 ℃孵育45 min；PBS 洗3次，用DAB 顯色試劑盒顯色，蘇木精對比染色，脫水和封固。光學顯微鏡下觀察并拍照。

1.6 蛋白質印跡法檢測卵巢組織中關鍵蛋白含量

利用美國Thermo Fisher Scientific 公司的TPER 組織蛋白提取試劑提取小鼠卵巢和子宮組織中總蛋白，測定蛋白質濃度。取200 μL 組織蛋白樣品，每孔上樣15 μL，進行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（9% 分離膠，5% 濃縮膠）電泳：80 V 恒壓15～20 min，140 V 恒壓至指示劑到達凝膠下端。

電泳結束后，將分離蛋白條帶電轉移至聚偏二氟乙烯膜上：200 mA 恒定電流3 h。然后用6% 脫脂奶粉封閉液（4% 預冷）封閉后，加入一抗（抗UCH-L1、FSHR、LHR、ER-β 和PR-A抗體同1.5 節，稀釋比例分別為1∶1000、1∶400、1∶250、1∶1000 和1∶1000；兔抗GAPDH單克隆抗體購自英國Abcam公司，稀釋比例為1∶2000），4 ℃孵育過夜。TBST 緩沖液洗膜6次×10 min后，加入堿性磷酸酶標記的山羊抗兔二抗（1∶4000），室溫搖床上反應1 h。TBST 緩沖液洗膜6次后，采用電化學發光法顯色，放入成像系統中拍照。

1.7 RNA干擾UCH-L1表達后檢測卵母細胞成熟情況

將12 周齡的C57BL/6J 雌性小鼠分籠飼養，于9∶00 左右注射孕馬血清（購自寧波第二激素廠）7.5 U/只。48 h 后麻醉致死小鼠，取出卵巢組織，用注射器刺破卵泡，釋放出卵丘卵母細胞復合體。用透明質酸酶（美國Sigma 公司產品）進行消化，去除顆粒細胞，收集GV 期卵母細胞。根據GenBank 中UCH-L1 基因序列，由蘇州金唯智生物科技有限公司合成UCH-L1 siRNA序列（5'-GGAAGTTAGCCCTAAAGT-3'），同時合成一段無意義序列作為陰性對照。將這2 種序列分別注射入GV 期卵母細胞，即實驗分為siRNA 干擾組和陰性對照組，每組各5 只，重復3次。注射用固定針的外徑為120μm，內徑為20μm；注射針孔徑為20μm。注射RNA 質量濃度為100 ng/μL。

將注射后的卵母細胞接種于事先配制好的特定培養液（TCM199 基礎培養液中添加10%胎牛血清、0.05 U/mL FSH、0.05 U/mL LH、1 μg/mL 17β 雌二醇、24.2 mg/L 丙酮酸鈉、10 ng/mL EGF、100 U/mL 青霉素和10 μg/mL 硫酸鏈霉素）中培養24 h，觀察并統計GV 期卵母細胞成熟為MⅠ期卵母細胞的情況。

1.8 統計學方法

采用SPSS 19.0 軟件進行統計學分析，2 組間比較采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05 認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 UCH-L1 基因缺失雜合子小鼠的子代基因型

UCH-L1＋/－小鼠自交獲得8 只仔鼠（編號為1#～8#），提取DNA 并鑒定小鼠基因型。PCR結果顯示：4#、5#、6#和8#小鼠在213 bp 處有1個PCR條帶，提示為UCH-L1＋/＋（野生型）；1#小鼠在447 bp 處有1個PCR 條帶，提示為UCH-L1－/－（純合型）；2#、3#和7#小鼠在213 bp 和447 bp 處各有1個PCR 條帶，提示為UC H-L1＋/－（雜合型）（圖1 A）。

2.2 UCH-L1－/－純合型雌性小鼠的體表與子宮形態

由于屬常染色體顯性遺傳，UCH-L1＋/－小鼠沒有出現異常表型，而UCH-L1－/－小鼠在出生時與UCH-L1＋/＋和UCH-L1＋/－小鼠也無明顯區別；9 周齡時，UCH-L1－/－小鼠體質量偏低，毛發粗糙，掉毛現象嚴重（圖1 B），而且運動困難，靜止時不自主顫抖，但其性腺外觀看似正常（圖1C）。取9 周齡的3 種基因型小鼠各1 只，經陰道涂片確定其處在發情間期（需要說明的是，純合型小鼠沒有發情周期，不能確定其所處的發情時期），將小鼠麻醉致死，取子宮組織進行觀察；肉眼可見雜合型和野生型小鼠子宮沒有明顯區別且體積正常，而純合型小鼠子宮明顯偏細（圖1 D ）。

2.3 UCH-L1 基因缺失雌性小鼠的繁殖能力

陰道涂片顯示，UCH-L1＋/－雜合型母鼠的發情周期正常，陰道脫落細胞呈周期性的變化，能夠清晰地分辨出發情前期、發情期、發情后期和間情期（圖2A～D）；而UCH-L1－/－純合型母鼠的陰道涂片顯示大量持續性的白細胞和少量皺縮的上皮細胞（圖2 E ～H），無周期性變化。

圖1 UCH-L1＋/－小鼠自交子代小鼠的基因型檢測以及UCH-L1 基因缺失雌性小鼠的體表與子宮形態觀察Figure 1 PCR detection of offspring mouse genotypes after the inbreeding of UCH-L1＋/－ mice, and the observation of body surface and uterus morphology in female mice with UCH-L1 gene deletion

圖2 小鼠陰道涂片檢測發情周期Figure 2 Vaginal smear test for estrous cycle of UCH-L1＋/－ and UCH-L1－/－ mice

繁育試驗顯示，UCH-L1＋/－雜合型4 只母鼠全部產仔，產仔數為37 只，平均每窩產仔數為9.25；而UCH-L1－/－純合型的4只母鼠無一產仔。

2.4 UCH-L1 基因缺失效果在雌性小鼠生殖系統中的驗證

對3個基因型（UCH-L1－/－、UCH-L1＋/－和UCH-L1＋/＋）的雌鼠采用蛋白質印跡法檢測UCH-L1 蛋白表達，結果顯示：UCH-L1－/－雌鼠卵巢和子宮中完全沒有表達UCH-L1；而UCH-L1＋/－和UCH-L1＋/＋雌鼠卵巢中UCH-L1 高表達，子宮中有少量表達；其中UCH-L1＋/＋雌性小鼠子宮中的UCH-L1 表達水平高于UCH-L1＋/－小鼠（圖3）。

免疫組織化學檢測結果（圖4 ）顯示：UCH-L1－/－小鼠卵巢組織中未檢測到UCH-L1蛋白的陽性信號（圖4A 和B）；在UCH-L1＋/－（圖4C 和D）和UCH-L1＋/＋（圖4E 和F）小鼠卵巢組織中都檢測出較強的UCH-L1 蛋白陽性信號，而且卵母細胞中UC H-L1 信號更明顯，在顆粒細胞和黃體中也有較高強度的UCH-L1 蛋白信號。

圖3 蛋白質印跡法檢測各基因型雌性小鼠卵巢和子宮中UCH-L1 蛋白表達Figure 3 Western blotting detection of UCH-L1 protein in ovary and uterus of three genotypes of female mice

圖4 免疫組織化學檢測各基因型雌性小鼠卵巢組織中UCH-L1 蛋白表達Figure 4 Immunohistochemical detection of UCH-L1 protein in ovary tissues of three genotypes of female mice

2.5 成年UCH-L1－/－和UCH-L1＋/－小鼠卵巢中生殖關鍵激素受體的表達及分布

采用蛋白質印跡法檢測成年UCH-L1－/－和UCH-L1＋/－小鼠卵巢和子宮組織中FSHR、LHR、ER-β 和PR-A表達水平，結果顯示：UCH-L1－/－小鼠卵巢中ER-β的表達水平明顯低于UCH-L1＋/－小鼠（P＝0.012＜0.05），而FSHR、LHR 和PR-A 的表達水平沒有明顯差異；在UCH-L1－/－和UCH-L1＋/－小鼠子宮組織中，FSHR、LHR、ER-β 和PR-A的表達水平沒有明顯差異（圖5A和B ）。

通過免疫組織化學法檢測成年UCH-L1－/－和UCH-L1＋/－小鼠卵巢組織中FSHR、LHR、ER-β 和PR-A 的表達和分布，結果如圖6 所示。FSHR 在兩種小鼠卵巢中都有表達，定位于卵母細胞和顆粒細胞，而且卵母細胞中表達較豐富；LHR 主要在顆粒細胞中表達，兩種小鼠都有微量表達；ER-β也是在卵母細胞和顆粒細胞中都有表達，卵母細胞中表達更豐富；PR-A 在兩種小鼠的卵泡腔和卵母細胞膜上都有表達。

2.6 UCH-L1 基因缺失小鼠卵巢及卵泡形態觀察

對成年UCH-L1－/－和UCH-L1＋/－小鼠卵巢組織切片進行HE 染色后觀察發現，UCH-L1－/－小鼠的卵巢縱切面明顯小于UCH-L1＋/－小鼠的卵巢縱切面，表明UCH-L1 缺失純合型小鼠的卵巢體積明顯小于雜合型小鼠。另外，UCH-L1－/－小鼠卵巢皮質層存在一些原始卵泡或閉鎖卵泡，沒有觀察到有腔卵泡和黃體（圖5A～F）；而UCH-L1＋/－小鼠卵巢存在多個有腔成熟卵泡（圖5G～H）。

圖5 UCH-L1－/－和UCH-L1＋/－小鼠卵巢和子宮組織中關鍵受體蛋白的蛋白質印跡檢測Figure 5 Western blotting detection of key receptor proteins in ovarian tissues of UCH-L1－/－ and UCH-L1＋/－ mice

2.7 UCH-L1下調對卵母細胞成熟的影響

通過RNA干擾的方法下調C57BL/6雌性小鼠GV 期卵母細胞中UCH-L1 的表達后，探索UCHL 1 對卵母細胞成熟的影響。結果表明，下調UCH-L1表達能顯著降低卵母細胞的成熟率（P＝0.023，圖8A 和B）。

圖7 UCH-L1－/－和UCH-L1＋/－小鼠卵巢切片的蘇木精-伊紅染色Figure 7 Hematoxylin-eosin staining of UCH-L1－/－and UCH-L1＋/－ mouse ovarian sections

圖8 RNA 干擾UCH-L1 表達對卵母細胞成熟率的影響Figure 8 Effect of UCH-L1 knockdown by RNA interference on the rate of oocyte maturation

3 討論

UCH-L1 是一種重要的去泛素化酶，參與調節細胞的增殖、分化和凋亡，以及神經退行性疾病的發生，而且在精子生成、卵子發育和受精等過程中發揮作用[11,13]。UCH-L1 基因缺失小鼠被成功引進后，嚴格按照SPF 級標準進行飼養和繁殖。根據孟德爾遺傳定律可知：雌性雜合子和雄性雜合子進行交配繁殖，其子代會出現3 種基因型：野生型（UCH-L1＋/＋）、雜合型（UCHL1＋/－）和純合型（UCH-L1－/－）[14]。本研究中基因型鑒定結果符合預期，即得到了UCH-L1基因完全缺失的純合型雌性子代小鼠。文獻顯示UCH-L1 缺失影響生殖功能[15-17]。本研究中，將純合型小鼠作為UCH-L1 缺失實驗組，而雜合型小鼠作為對照組；初步鑒定顯示，該基因缺失（靶向敲除了正常小鼠UCH-L1 基因中第6～8個外顯子及第9個外顯子的前6個堿基）雜合型小鼠的表型完全正常；純合型小鼠則表現出協調能力受損、體質量偏低、毛發粗糙及脫毛現象嚴重，且運動困難，靜止時不自主顫抖，雖然其性腺外觀正常，但解剖發現子宮和卵巢都發育不良，子宮偏細，卵巢體積明顯小于野生型小鼠卵巢體積。

本研究還發現，UCH-L1 缺失雌性小鼠不具備發情周期。利用陰道涂片法可以觀察小鼠發情周期各階段的陰道內部細胞組織形態學變化。由于陰道上皮細胞種類是隨著小鼠排卵周期而變化的，由此推斷UCH-L1缺失雌性小鼠可能沒有排卵活動，間接說明其卵巢功能發育不完善。繁殖實驗也進一步說明該小鼠不具備生育后代的能力。

免疫組織化學染色結果顯示，純合型缺失小鼠的卵巢皮質層僅存在一些原始卵泡或閉鎖卵泡，沒有腔卵泡和黃體，說明沒有成熟卵泡形成和排卵活動（圖5）。同時，通過RNA 干擾的方法敲降GV 卵母細胞中UCH-L1 的表達后，發現UCH-L1 表達下調能顯著降低卵母細胞的成熟率，說明UCH-L1 參與了卵母細胞的成熟過程。有研究證明，在GV 和M Ⅱ期卵母細胞中能夠檢測到較多的UCH-L1 mRNA，與卵母細胞皮層相關；而給GV期卵母細胞微量注射UCH 家族酶抑制劑后，發現卵母細胞的減數分裂被阻滯在MⅠ期，導致極體異常[12]。因此，當純合型缺失小鼠卵巢中沒有UCH-L1 表達時，卵泡的發生和發育受到影響，卵巢中不能形成成熟卵母細胞，取而代之的是出現大量原始卵泡和初級卵泡。

進一步的蛋白質印跡法和免疫組織化學染色結果顯示，在純合型和雜合型小鼠的卵巢和子宮中，與卵母細胞成熟和排卵相關的關鍵受體FSHR、LHR、ER-β 和PR-A 的定位和表達沒有明顯差異。值得注意的是，UCH-L1＋/－雜合型小鼠卵巢中ER-β 表達量明顯高于純合型小鼠。

在生殖系統中主要存在兩種雌激素受體：ER-α和ER-β。關于ER在卵巢及卵母細胞發育中的作用，目前研究主要集中在ER-β[18-19]。ER-β主要存在于生長卵泡的顆粒細胞中[18]，也可在一些間質細胞中表達[20]。ER-β 表達在卵泡發育的不同時期呈現階段性特異性表達，在原始卵泡的顆粒細胞中表達量較少，在竇腔形成初期的卵泡中表達增加，在竇腔高度發展階段的卵泡中表達量最多。已知雌激素主要來源于卵泡顆粒細胞，雌激素和FSH 協同作用，刺激顆粒細胞有絲分裂和卵泡腔形成，從而促進卵母細胞成熟和優勢卵泡排出[21]。由此推測，UCH-L1 基因缺失雌性小鼠卵巢中沒有UCH-L1蛋白的表達，造成ER-β表達量降低，進而發生排卵障礙。這與之前的發情周期觀察和卵巢切片HE 染色結果相互印證，都說明UCH-L1 缺失雌性小鼠的生殖功能存在障礙。但是，UCH-L1 缺失是怎樣造成ER-β 降低的，還需要進一步研究探討。

綜上所述，UCH-L1 缺失純合型雌性小鼠不具備形成成熟卵泡及排卵的能力，卵巢中ER-β 表達量顯著降低，推測UCH-L1有可能通過下調卵巢中ER-β 的表達，影響卵母細胞成熟及排卵過程。