加速溶劑萃取-超高效液相色譜聯(lián)用同時測定食品紙包裝中的兩種熒光增白劑

黃金飛 駱立剛 段 然

(浙江省家具與五金研究所，杭州 310013)

白度是衡量食品紙包裝產(chǎn)品質(zhì)量的一項重要指標(biāo)，在制作過程中，為了抵消原材料中纖維和膠料填料本身的微黃色，人們會在其中加入熒光增白劑來提高紙質(zhì)包裝產(chǎn)品的白度。熒光增白劑廣泛應(yīng)用在紡織、造紙、洗衣粉、肥皂、橡膠、塑料、顏料和油漆等方面[1,2]。食品紙包裝行業(yè)使用的增白劑主要為三嗪氨基二苯乙烯型增白劑，主要有VBL和APC兩種。VBL中文別名熒光增白劑85，名稱為4,4’-雙[(4-苯胺基-6-羥乙基氨基-1,3,5-三嗪-2-基)氨基]二苯乙烯-2,2’-二磺酸二鈉鹽，，CAS號12224-06-5；APC中文別名熒光增白劑220，名稱為4,4’-二(4-(二(2-羥基乙基)氨基-6-(4-磺酸苯胺基)-1,3,5-三嗪-2-基)氨基) 對稱二苯代乙烯-2,2’-二磺酸四鈉 ， CAS號16470-24-9。

熒光增白劑具有典型的環(huán)狀共軛結(jié)構(gòu)，極易被人體的消化系統(tǒng)的粘膜組織所吸收。這類物質(zhì)通過食品紙包遷移到食品中，再被人體消化，會很快進(jìn)入人體循環(huán)后達(dá)到各個器官[3,4]。由于其分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不易被分解，長期累積下來，會讓細(xì)胞發(fā)生變異，是潛在的致癌因素。相關(guān)研究表明，接觸含熒光增白劑的食品包裝材料時，人體皮膚可能吸附熒光增白劑的量是0.001～0.03 mg/(kg體重·d)，若接觸過量，會增加致癌的風(fēng)險[5-7]。我國頒布的《食品包裝用原紙衛(wèi)生管理辦法》中明確規(guī)定禁止添加熒光增白劑等有害助劑[5]。國際上也對熒光增白劑提出了限定要求，如歐洲委員會2009 年2月12 日頒布了《1 號技術(shù)文件——預(yù)期接觸食品的紙和紙板材料及制品生產(chǎn)使用的物質(zhì)清單》要求26 種二苯乙烯類熒光增白劑遷移量不得檢出。意大利衛(wèi)生部1973 年3 月21 日部長令《預(yù)期與食品或個人用品接觸包裝、容器和用具的衛(wèi)生控制》規(guī)定熒光增白劑的允許添加量(單獨或組合使用)不得超過總量的0.3%( 質(zhì)量百分比，以干基計)[8-10]。

目前國內(nèi)外對對熒光增白劑的檢測方法有白度法、熒光白度法、紫外燈照射法、熒光分光光度法、紫外分光光度法，以及液相色譜熒光法和液相色譜質(zhì)譜法[11-16]。本實驗采用加速溶劑萃取(ASE)和高效液相色譜-二極管陣列(HPLC)聯(lián)用技術(shù)，在不使用離子對試劑的條件下，同時對食品包裝材料中的兩種熒光增白劑進(jìn)行定性定量分析，建立檢測方法。解決了目前分析樣品前處理溶劑消耗量大或回收率低的問題，延長了色譜柱的使用壽命，同時使用在實驗室普及率較高的二極管陣列檢測器為分析器，快速同時測定兩種具有代表性的紙用熒光增白劑，降低了試驗成本，具有較好的推廣意義。

1 試驗部分

1.1 儀器

ASE 350加速溶劑提取儀(ThermoFisher，美國)；10 mL萃取池；Vanquish系列超高效液相色譜系統(tǒng)(ThermoFisher，美國)，配二元高壓泵、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器；變色龍7.2數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。

1.2 試劑與材料

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)VBL，APC購自上海安譜實驗科技股份有限公司；甲醇，乙腈：Fisher公司；N，N-二甲基甲酰胺，N，N-二甲基乙酰胺：國藥集團(tuán)；水：18.2 MΩ/cm，Millipore公司。

1.3 樣品前處理

將樣品用剪刀剪成1 cm×1 cm大小的碎片，準(zhǔn)確稱量1 g，倒入事先墊有纖維過濾膜的10 mL萃取池中。采用ASE提取，定容至25 mL，過0.45 μm濾膜，待HPLC分析。

加速溶劑萃取條件：萃取溶劑為N，N-二甲基甲酰胺；萃取溫度為80℃；靜態(tài)萃取時間為5min，循環(huán)萃取2次；吹掃體積為60%，吹掃時間為120s。

1.4 分析條件

色譜柱：Acclaim 120 C18, 2.1*100 mm, 2.2 μm(ThermoFisher，美國)；柱流速：0.4 mL/min；進(jìn)樣體積：5 μL；柱溫：45℃；流動相：流動相A：水；流動相B：乙腈；檢測器波長：350nm。流動相：A：5 mM醋酸銨水溶液，B：甲醇，甲醇初始梯度15%, 2min升至35%，最后9min升至65%。色譜圖見圖1。

圖1 APC和VBL色譜圖(標(biāo)準(zhǔn)混合溶液濃度10 mg/L，APC和VBL的保留時間分別為4.12和8.09min)

2 結(jié)果與討論

2.1 萃取條件選擇

2.1.1ASE萃取溶劑選擇

本方法分別采用甲醇、乙腈、水、N，N-二甲基甲酰胺和N，N-二甲基乙酰胺對餐巾紙中的熒光增白劑加標(biāo)回收試驗。試驗結(jié)果表明：采用N，N-二甲基甲酰胺能取得最佳萃取效果，VBL和APC兩種熒光增白劑的回收率均大于80%。

2.1.2ASE萃取溫度選擇

本方法分別考察了40℃、60℃、80℃、100℃和120℃對熒光增白劑萃取效率的影響。實驗結(jié)果表明：隨著萃取溫度的增加，VBL和APC的萃取率隨之增加，80℃達(dá)到最佳；當(dāng)溫度大于80℃的時候，萃取率下降。綜合實驗結(jié)果，本方法選擇80℃作為后續(xù)的萃取溫度。

2.1.3ASE萃取循環(huán)次數(shù)選擇

本實驗以5min作為靜態(tài)萃取時間，考察循環(huán)次數(shù)對兩種熒光增白劑萃取率的影響。參考1.3部分進(jìn)行試驗，稱取1g樣品，設(shè)置萃取循環(huán)次數(shù)為1次。對該樣品連續(xù)萃取3次，分別收集萃取液，定容至25mL。采用UHPLC測試3個萃取液中VBL和APC的含量。實驗結(jié)果表明：第1次循環(huán)對VBL、APC的萃取量占總萃取量的96.1%，96.4%；第2次循環(huán)對VBL、APC的萃取量只占總萃取量的3.6%，3.5%；第3次循環(huán)對3種熒光增白劑的基本未檢出。綜合實驗結(jié)果，本方法選擇兩次循環(huán)。

最終ASE方法采用N，N-二甲基甲酰胺作為萃取溶劑，萃取溫度80℃，靜態(tài)萃取時間5min，循環(huán)2次。

2.2 紫外波長選擇

通過二極管陣列檢測器(DAD)在300～400 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，確認(rèn)APC和VBL的最大吸收波長分別為350和348.9 nm，考慮檢測方便性，以及VBL在350和348.9 nm處響應(yīng)差別很小，故方法統(tǒng)一選擇350 nm作為檢測波長(圖2)。

圖2 APC和VBL最大吸收波長二極管陣列檢測器掃描

2.3 色譜柱選擇

考察4種不同類型得到色譜柱對兩種熒光增白劑的分離效果。包括Hypersil Gold Vanuqish aQ (2.1*100 mm，1.9 μm，極性封端的C18固定相)，Acclaim 120 C18(2.1*100 mm，2.2μm，高載樣量的通用型C18固定相) ，Acclaim C8 (2.1*100 mm，3.0 um，高載樣量的通用型C8固定相)和Acclaim PAII(2.1*100 mm，2.2 μm，C18內(nèi)嵌酰胺基團(tuán)的交叉鍵合固定相)。發(fā)現(xiàn)四款色譜柱對兩種熒光增白劑均有較好的分離效果，其中APC結(jié)構(gòu)中有更多的磺酸基團(tuán)，極性相對VBL更強(qiáng)，因此在C18上保留較弱。綜合比較峰形、分離度等因素，以及考慮方法通用性，選擇Acclaim 120 C18色譜柱作為方法優(yōu)選色譜柱。

2.4 流動相選擇

有機(jī)相方面：選擇常用的甲醇和乙腈兩種有機(jī)相進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)乙腈對熒光增白劑的洗脫能力較強(qiáng)，尤其是APC在乙腈作為有機(jī)相時在色譜柱上基本無保留，而同樣條件下甲醇作為有機(jī)相時，兩種熒光增白劑在柱子上均有較好的保留，峰形、分離度均較為理想，故最終選擇甲醇作為有機(jī)相。

流動相添加劑選擇：比較了水-甲醇、乙酸銨-甲醇和乙酸-甲醇體系下兩種熒光增白劑的分離效果。使用5 mM乙酸銨水溶液-甲醇體系時，相對于純水相，可以增強(qiáng)待測物和固定相的相互作用，而當(dāng)使用乙酸水體系時，由于在低pH條件下APC和VBL結(jié)構(gòu)中磺酸根更多以磺酸形式存在，反相作用增強(qiáng)，使得兩種熒光增白劑在柱子上保留增強(qiáng)。在水-甲醇體系下峰形差，使用0.1%乙酸水溶液-甲醇體系時，分離度差，兩種體系均不適合。在5 mM乙酸銨水溶液-甲醇體系下能兼顧待測物保留、峰形和分離度，故最終選擇5 mM乙酸銨水溶液-甲醇體系。

最終UHPLC條件為Acclaim 120 C18為色譜柱，采用5 mM乙酸銨水溶液-甲醇體系進(jìn)行分離，在12min之內(nèi)完成兩種熒光增白劑的分析檢測。在色譜柱分離萃取液的過程中，不使用離子對試劑條件下的分析參數(shù)，解決了色譜柱固定相與離子對試劑結(jié)合而減少壽命的問題[11,12]；在檢測器端，采用了使用較為廣泛的二極陣列管檢測器來進(jìn)行分析，解決了熒光檢測器適用范圍較窄，質(zhì)譜檢測器較為復(fù)雜昂貴的問題[4, 11, 14,15]。

2.5 方法學(xué)數(shù)據(jù)

分別配制0.05、0.10、0.50、1.0、5.0、10.0和20.0 mg/L的2種熒光增白劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。考察儀器線性。實驗結(jié)果表明兩種組分在0.05～20.0 mg/L此區(qū)間線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.9998(見表1)。以3倍信噪比(S/N)計算各組分檢出限，結(jié)果樣品前處理過程，VBL和APC檢出限分別為0.036和0.06 mg/kg。同時對0.1 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)6針，考察儀器穩(wěn)定性，儀器RSD分別為1.2%和0.8%之間，儀器穩(wěn)定性滿足要求。

采用1.0、5.0、10.0 mg/kg 3個加標(biāo)水平，分別考察該方法的加標(biāo)回收率。實驗結(jié)果表明，1.0～10.0 mg/kg的加標(biāo)情況下，加標(biāo)回收率范圍為83.7～95.8%，滿足分析檢測要求，見表1。

表1 檢出限、線性、加標(biāo)回收率及RSD

2.6 樣品分析

于市場上選擇3品類包裝紙，采用本方法進(jìn)行分析檢測。將樣品用剪刀剪成1 cm×1 cm大小的碎片，準(zhǔn)確稱量1g，倒入事先墊有纖維過濾膜的10 mL萃取池中。采用ASE提取，定容至25 mL，過0.45 μm濾膜，待HPLC分析。實驗結(jié)果表明：各種包裝紙中均含不同程度的熒光增白劑，需要有關(guān)部門的監(jiān)督管理，避免各類熒光增白劑危害消費者的安全(表2、圖3)。

圖3 樣品及樣品加標(biāo)色譜圖(加標(biāo)量為1.0 mg/kg)

表2 樣品分析結(jié)果 mg/kg

3 結(jié)論

采用加速溶劑萃取-液相色譜法(ASE-HPLC)測定食品包裝材料中的APC和VBL 2種熒光增白劑。實驗優(yōu)化了ASE前處理條件，在以萃取溶劑為N，N-二甲基甲酰胺；萃取溫度為80℃；靜態(tài)萃取時間為5min，循環(huán)萃取2次時，能達(dá)到最佳萃取狀態(tài)，整個樣品前處理只需要20min即可完成，無須經(jīng)過繁瑣的人工前處理過程，不僅時間消耗少，試劑消耗量少，并且操作簡單，回收率高。結(jié)合超高效液相色譜法，本方法采用常見的甲醇和緩沖鹽作為流動相，摒棄了文獻(xiàn)報道的離子對色譜法，簡化了液相色譜方法，提高液相色譜柱的使用壽命。同時兼具儀器靈敏度高，穩(wěn)定性好，分析速度快等特點。本方法是食品紙包裝材料中熒光增白劑測定的快捷有效的方法。