超高效液相色譜測(cè)定飲料中的阿斯巴甜和阿力甜

金博艷

(上海市崇明食品藥品檢驗(yàn)所 崇明食品安全檢測(cè)中心, 上海 202150 )

阿斯巴甜和阿力甜作為甜味劑，允許根據(jù)限量使用添加至多類食品中，兩者均為人工合成的非碳水化合物類的人造甜味劑，因?yàn)樘鸲雀撸瑹崃康停啾粡V泛應(yīng)用于飲料、果凍等食品中作為糖的替代品[1]。雖然人工合成甜味劑在很大程度上有著降低熱量的攝入，改善糖尿病人的口感等優(yōu)點(diǎn)，但是人工合成甜味劑也需限量使用，若超范圍使用或者濫用，可能引起不同程度的毒性表現(xiàn)[2，3]。所以對(duì)于日常食品中的甜味劑的檢測(cè)工作還是很有必要的。

目前，各類期刊文獻(xiàn)的研究中關(guān)于食品中阿斯巴甜和阿力甜的檢測(cè)方法主要有液相色譜法[4-6]、液相色譜-質(zhì)譜法[7]，但是液相色譜法因紫外-可見(jiàn)光檢測(cè)器存在末端吸收，會(huì)出現(xiàn)吸收光譜向上飄移的現(xiàn)象，導(dǎo)致干擾多，不利于檢測(cè)，而液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用則存在著檢測(cè)成本高的缺點(diǎn)。考慮日常檢測(cè)工作需低成本、快速、高效且結(jié)果準(zhǔn)確，在液相色譜的基礎(chǔ)上，選擇超高效液相色譜，這樣能快速的進(jìn)行目標(biāo)物分析，達(dá)到高效檢測(cè)的目的。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器和設(shè)備

超高效液相色譜儀(1290 Infinity Ⅱ,安捷倫科技)，帶有二極管陣列檢測(cè)器；電子天平(ME104E，梅特勒)；水浴鍋(SW22，Julabo)；勻漿機(jī)(T18，IKA)；渦旋儀(LP Vortex Mixer，賽默飛)；超聲震蕩儀(SK8200HP，科導(dǎo))；低溫高速離心機(jī)(ST8R，賽默飛)。

1.2 試劑和耗材

甲醇(4L/瓶，色譜純，德國(guó)CNW)；離心管(50mL，上海安譜)；水相濾頭(0.45μm，安譜)；一次性針筒注射器(5mL，上海安譜)；一次性滴管(3mL，上海安譜)等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1樣品前處理

以碳酸飲料作為基質(zhì)，準(zhǔn)確稱取樣品5g(精確到0.001g)于50mL離心管中，在50℃水浴上除去二氧化碳，經(jīng)超聲震蕩提取20min，然后用一級(jí)水定容至25ml，混勻，經(jīng)0.45μm水相濾頭過(guò)濾后用于超高效液相色譜分析[8]。

以果粒橙等飲料為基質(zhì)，準(zhǔn)確稱取樣品5g(精確到0.001g)于50mL離心管中，加入5mL水，用高速勻漿機(jī)將樣品制備均勻，經(jīng)超聲震蕩提取20min，然后用一級(jí)水定容至25mL，混勻，4000r/min離心5min,將上清液經(jīng)0.45μm 有機(jī)系濾膜過(guò)濾后用于超高效液相色譜分析。

1.3.2標(biāo)準(zhǔn)品及標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

阿斯巴甜，純度：99.3% 來(lái)源：Sigma-Aldrich， 批號(hào)：LRAB6662，稱取0.00504g標(biāo)準(zhǔn)品，用水溶解并轉(zhuǎn)移定容至10mL容量瓶中，配制成0.5mg/mL阿斯巴甜標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

阿力甜，純度：98% 來(lái)源：Toronto Research Chemicals， 批號(hào)：1-MJS-5-1-PFZ，稱取0.00510g標(biāo)準(zhǔn)品，用水溶解并轉(zhuǎn)移定容至10mL容量瓶中，配制成0.5mg/mL阿力甜標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

分別吸取阿斯巴甜、阿力甜標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各1mL,定容至5mL，配制成100μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液。分別吸取混合標(biāo)準(zhǔn)使用液10μL、20μL、30μL、40μL、50μL定容至1mL，配制成1μg/mL、2μg/mL、3μg/mL、4μg/mL、5μg/mL標(biāo)準(zhǔn)系列，待測(cè)。

1.3.3超高效液相色譜測(cè)定條件

色譜柱：C18柱，粒徑1.8μm，規(guī)格0.3×10cm；檢測(cè)器：DAD；流動(dòng)相程序：甲醇+水恒比例50∶50；流速：0.3mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)：200nm; 帶寬：4.0nm；柱溫:30℃；進(jìn)樣體積：20μL。

1.3.4數(shù)據(jù)處理

采用安捷倫Chemstation 工作軟件,版本：C.01.07.[27]進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 波長(zhǎng)的選擇

分別取阿斯巴甜和阿力甜的標(biāo)準(zhǔn)溶液，流動(dòng)相恒定的情況下，在波長(zhǎng)190nm～400nm進(jìn)行最大波長(zhǎng)掃描，結(jié)果顯示，阿斯巴甜和阿力甜在195～215nm之間均有吸收，且呈遞減狀態(tài)，見(jiàn)圖1。取兩者的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，選擇一個(gè)可定量的穩(wěn)定的濃度，測(cè)定不同波長(zhǎng)下的產(chǎn)生的相關(guān)信息，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同波長(zhǎng)下阿斯巴甜、阿力甜的吸收值

圖1 阿斯巴甜和阿力甜的的波長(zhǎng)掃描圖

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果顯示，阿斯巴甜和阿力甜在195～200nm之間的能同時(shí)達(dá)到最大吸收，阿斯巴甜在195nm處吸收大于200nm處的吸收，阿力甜在200nm處的吸收大于195nm處的吸收，鑒于這種情況，配制檢出限及低于檢出限的的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別于195、200nm進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果如表2所示。

表2 檢出限及檢出限以下的濃度的檢測(cè)結(jié)果

結(jié)果顯示，在同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)的情況下，阿斯巴甜和阿力甜在200nm條件下的信噪比均優(yōu)于195nm，所以本方法選取200nm作為阿斯巴甜和阿力甜的檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2 色譜流動(dòng)相的選擇

在波長(zhǎng) 200 nm的檢測(cè)條件下，流動(dòng)相甲醇與水比例從30∶70到70∶30不同比例進(jìn)行測(cè)試，兩組分的出峰時(shí)間和分離度如表3。

表3 不同比例流動(dòng)相條件下的2種組分的出峰時(shí)間

根據(jù)不同比例流動(dòng)相的試驗(yàn)結(jié)果顯示，在有機(jī)相甲醇比例逐漸增加的情況下，兩組分的出峰時(shí)間逐漸縮短，當(dāng)有機(jī)相比例超過(guò)60%以后，阿斯巴甜的出峰時(shí)間跟溶劑峰的出峰時(shí)間接近，對(duì)目標(biāo)組分的分離度上有一定的影響，同時(shí)考慮飲料中含有其他甜味劑或添加劑的影響，不選擇時(shí)間跨度小于2分鐘的，防止多組分的出峰時(shí)間重疊。為了達(dá)到高效快速的目的，選擇50∶50的甲醇和水作為本方法的流動(dòng)相，在這個(gè)比例下的檢測(cè)時(shí)間能在40+60的基礎(chǔ)上縮短一半的檢測(cè)時(shí)間。分離結(jié)果如圖2所示。

圖2 50+50甲醇和水條件下的阿斯巴甜和阿力甜

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線得回歸方程及線性

通過(guò)2.1、2.2的不同條件測(cè)試，最終以200nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，甲醇與水的比例為50∶50作為流動(dòng)相，測(cè)試系列濃度標(biāo)準(zhǔn)工作溶液線性方程及線性系數(shù)，結(jié)果如表4。

表4 線性范圍的回歸方程及線性系數(shù)

試驗(yàn)得到的兩組分的線性系數(shù)均在0.998以上，完全符合實(shí)驗(yàn)要求。

2.4 精密度及回收率實(shí)驗(yàn)

以飲料為基質(zhì)，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)方法GB 5009.263-2016的檢出限(1.0mg/kg、5μg)、定量限(3.0mg/kg、15μg)和10倍檢出限(10.0mg/kg、50μg)6水平加標(biāo)實(shí)驗(yàn)[9]，分別得到精密度及回收率，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 飲料中阿斯巴甜和阿力甜的三水平回收率

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本方法兩組分三水平的的回收率在94.4～105.5之間，三水平的精密度測(cè)試的相對(duì)偏差在0.6～9.2之間，重復(fù)性穩(wěn)定。

3 結(jié)論

利用超高效液相色譜，在檢測(cè)波長(zhǎng)200nm，以50∶50的甲醇和水作為流動(dòng)相，流速0.3mL/min的條件下，能使飲料中的阿斯巴甜和阿力甜的檢出限達(dá)到0.75mg/kg ,低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.263-2016方法檢出限1mg/kg，且信噪比均大于3，符合檢測(cè)要求。同時(shí)，隨著流動(dòng)相中有機(jī)相甲醇比例增加，使目標(biāo)物的出峰時(shí)間大大縮短，有效的縮短了檢測(cè)的時(shí)間，提高了檢測(cè)效率。本法前處理簡(jiǎn)單，檢測(cè)快速高效，分離度好，適用于日常飲料中兩種甜味劑的檢測(cè)。