藤三七多糖的體外抗氧化活性研究

柳 楊 趙紅喜

藤三七又名洋落葵，是落葵科落葵屬蔓生植物[1]，具有滋補(bǔ)強(qiáng)壯、活血化瘀、通脈止痛、調(diào)脂降壓等功效，常用于治療腰膝痛、風(fēng)濕痛、骨折、血虛血滯等癥[2]。藤三七所含化學(xué)成分包括拉里亞苷元、黃酮類、多糖、尿嘧啶及腺苷等化合物[3，4]。近年來，對(duì)多糖的活性研究表明，其中部分多糖對(duì)多種活性氧具有清除功效。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，落葵多糖具有較強(qiáng)的抗氧化活性[5]，藤三七作為落葵科植物其多糖是否亦具有抗氧化活性值得探討。因此本研究通過對(duì)藤三七多糖的體外抗氧化活性進(jìn)行探討，以期對(duì)其臨床應(yīng)用起到參考作用。

1 儀器與材料

AGBP210S 電子天平(Satorius公司)；AB135S分析天平(Mettlertoledo儀器上海有限公司)；UV-2501PC 紫外分光光度計(jì)(日本島津)；HS-25數(shù)顯pH計(jì)(上海精密儀器科學(xué)有限公司)；KQ5200B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；DILW型電子恒溫水浴鍋(北京永光明醫(yī)療儀器廠)。

鄰二氮菲、FeSO4、H2O2、鄰苯三酚、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、EDTA均為分析純，水為去離子水。

藤三七購自沁春源綠色保健蔬菜種苗開發(fā)研究中心，由沈陽藥科大學(xué)賈英教授鑒定為正品。

2 藤三七多糖的提取

取藤三七藥材約10 g，加入石油醚回流提取2次，每次2 h。棄去提取液，殘?jiān)?0 %乙醇100 ml回流提取2次，每次2 h。棄去提取液，殘?jiān)诱麴s水回流，提取3次，每次2 h。合并提取液，濃縮至40 ml，用Sevage法除去蛋白。水層加入95 %乙醇，靜置，離心棄去上清液，沉淀先后用無水乙醇、丙酮、無水乙醚多次洗滌，真空干燥，即得藤三七多糖。

3 藤三七多糖對(duì)·OH清除率的測(cè)定(H2O2/Fe2+體系法)

3.1 H2O2/Fe2+反應(yīng)體系原理Fenton反應(yīng)是最常見的產(chǎn)生羥自由基的化學(xué)反應(yīng),在H2O2/Fe2+體系法中通過Fenton反應(yīng)，H2O2產(chǎn)生·OH，鄰二氮菲-Fe2+被·OH氧化為鄰二氮菲-Fe3+，其536 nm處吸收峰消失，因此測(cè)定536 nm處吸收值的變化可分析·OH的變化[6]。

3.2 溶液的配制多糖樣品溶液的配制：取藤三七多糖4 mg，置于10 ml量瓶中，用水定容，備用。0.75 mmol·L-1鄰二氮菲溶液的配制：取200 mg鄰二氮菲，加無水乙醇溶解成20 ml，取此溶液3.75 ml，用蒸餾水稀釋至250 ml，搖勻，即得。150 mmol·L-1pH值7.4 PBS溶液的配制甲液：取7.164 g Na2HPO4·12 H2O，加水溶解，并稀釋至100 ml。乙液：取3.12 g NaH2PO4·2 H2O，加水溶解，并稀釋至100 ml。取上述甲液81 ml與乙液19 ml混合，搖勻，稀釋成150 ml，即得。

3.3 樣品的測(cè)定將各多糖樣品配成濃度為4 mg·ml-1的溶液。取6支試管，分別加入0.75 mmol·L-1鄰二氮菲溶液1 ml，150 mmol·ml-1pH 7.4 PBS 1.5 ml，充分混勻后，加入0.75 mmol·L-1FeSO4溶液1 ml，每加1管立即混勻，然后向其中一管加入0.01% H2O21 ml(損傷)，另一管不加H2O2(未損傷)，以蒸餾水補(bǔ)充體積，37 ℃保溫60 min后，以磷酸鹽緩沖液為參比，分別測(cè)536 nm時(shí)吸收值，得A損傷與A未損傷。其余4管分別加入一定的其他多糖溶液，混勻，再分別加入0.01 %H2O21 ml，37 ℃保溫60 min后以同濃度的多糖液作參比，測(cè)536 nm時(shí)的吸收值，即得A樣。重復(fù)5次，用下式計(jì)算·OH清除率：·OH清除率(S%)=(A樣-A損傷)/(A未損傷-A損傷)×100%

表1 樣品和試劑的加入量

在上述條件下，藤三七多糖對(duì)·OH具有清除作用，且隨著藤三七多糖的增加，清除率上升，存在一定的量效關(guān)系，最大清除率可達(dá)到43.83%。藤三七多糖對(duì)·OH清除率的結(jié)果見圖1。

圖1 藤三七多糖對(duì)·OH消除率

4 藤三七多糖對(duì)清除率的測(cè)定(鄰苯三酚自氧化法)

4.2 鄰苯三酚自氧化速率測(cè)定取4.5 ml pH 8.2 50 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液，1.2 ml蒸餾水，混勻后加入25 ℃預(yù)熱過的鄰苯三酚0.3 ml(以10 mmol·L-1HCl配制，空白管用10 mmol·L-1HCl代替鄰苯三酚的HCl溶液)，迅速搖勻，倒入比色杯，325 nm下每隔30 s測(cè)定吸光度，計(jì)算每分鐘吸光度的增加△A0。

表2 樣品和試劑的加入量

4.3 樣品的測(cè)定取藤三七多糖4 mg，精密稱定，以蒸餾水溶解定容至10 ml量瓶中，在加入鄰苯三酚前，先加入一定體積的多糖溶液，蒸餾水減少，然后按下述方法計(jì)算清除率。清除率(%)=(△Ao―△A)/(△Ao)×100%。其中：△Ao為鄰苯三酚自氧化速率，△A為加入多糖溶液后鄰苯三酚的自氧化速率。

表3 樣品和試劑的加入量

圖2 藤三七多糖對(duì)的清除率

5 討論

本研究證明藤三七多糖在一定的濃度范圍內(nèi)，對(duì)羥自由基有較好的清除作用，多糖濃度越大，清除作用越強(qiáng)，呈明顯量效關(guān)系；對(duì)超氧陰離子自由基也有清除作用，且亦呈明顯量效關(guān)系。

鄰苯三酚在堿性條件下能迅速自氧化，并產(chǎn)生超氧陰離子，加速鄰苯三酚的自氧化速率，同時(shí)產(chǎn)生有色中間產(chǎn)物，根據(jù)鄰苯三酚自氧化速率測(cè)定方法，采用紫外分光光度計(jì)在190～700 nm范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果表明325 nm處有強(qiáng)烈吸收，變化顯著，并且樣品無干擾，因此檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)定為325 nm。