淺談無細胞蛋白質合成系統的分類和應用

陳紹華

摘 要 無細胞蛋白質合成（CFPS）是一種技術平臺，為蛋白質表達、代謝工程、治療發展、教育等提供了新的機會。CFPS相對于體內蛋白質表達的優勢包括其開放的系統，消除對活細胞的依賴，以及將所有系統能量集中在生產感興趣的蛋白質上的能力。在過去的60年里，CFPS平臺已經大大發展和多樣化，并會繼續發展。當前發展領域的新應用和新類型都是基于多種生物提取物。本文主要介紹高采納平臺的應用，從應用的角度來闡明這些平臺的差異。

關鍵詞 無細胞蛋白合成（CFPS）;體外轉錄-翻譯（TX-TL）;無細胞蛋白表達（CFPE）;體外蛋白質合成;無細胞合成生物學

引言

蛋白質作為重要的生物大分子，是所有生物體維持結構、功能的必需物質[1]。無細胞蛋白質合成（Cell-free Protein Synthesis，CFPS）大約在60年前出現，作為一個平臺，被尼倫伯格和馬特海伊用來破譯遺傳密碼，并發現mRNA與蛋白質合成之間的聯系。自這一發現以來，CFPS平臺已經成長為各種應用，從功能基因組學到大規模抗體生產。

目前，CFPS已經使用來自許多不同生物體的細胞提取物來實現，其獨特的生物化學特性使其能夠廣泛應用。對CFPS日益增長的興趣是與平臺開放性質相關的關鍵優勢的結果。CFPS反應缺乏細胞膜和功能基因組，因此不受細胞生命目標的限制。因此，當試圖在體內產生大量重組蛋白時，細胞所承受的代謝和細胞毒性負擔在CFPS中是被避免了，可以直接操縱蛋白質生產環境，因為它是一個開放的系統。在某些情況下，使用CFPS可以獲得更高的蛋白質滴度，因為系統中的所有能量都被引導到生產感興趣的蛋白質中去。無細胞蛋白質合成系統已成為十分重要的蛋白質合成系統，在大規模表達重組藥物、制備蛋白質芯片等方面具有巨大的潛力。

1CFPS反應模式

作為一個開放和高度個性化的平臺，CFPS反應可以以多種格式執行，包括耦合、非耦合、批處理、連續流動、連續交換、凍干， 或微流控格式，這取決于用戶的需要。

除了基于細胞提取的CFPS試劑盒外，PURE 表達試劑盒包括重組大腸桿菌轉錄和翻譯機制的純化成分。 PURE（protein synthesis using recombinant elements）利用單獨純化的組分代替細胞提取物，其中包括10個翻譯因子：T7RNA聚合酶、20個氨基酰基-tRNA合成酶、核糖體、焦磷酸酶、肌酸激酶、肌激酶和核苷二磷酸激酶。該系統需要過表達和純化每個成分，但得益于沒有蛋白酶和核酸酶以及系統的確定性質，總的來說PURE系統比均質的細胞提取CFPS允許高純度和稍微容易操作的反應條件。然而，這些試劑盒相對自己生產和商業上可用的基于提取物的CFPS是十分昂貴的（$0.99/?L反應物），其生產力（～100?g/mL）也明顯低于它們的基于大腸桿菌提取物的CFPS對應物。

2無細胞蛋白合成的應用

2.1 平臺分類的介紹

在無細胞蛋白質合成出現的60年中，已經開發了許多基于各種生物的細胞提取物平臺。 包括細菌、植物、哺乳動物和人類細胞系的提取物。每個產生的平臺由于給定生物物種的獨特生物化學特性，而在易于制備、蛋白質產量和可能的應用中都有不同的結果。 本文中將這些不同的平臺分為兩類：高采納平臺和低采納平臺。

2.2 高采納平臺

高采納包括基于大腸桿菌、昆蟲、酵母、中國倉鼠卵巢、兔網織紅細胞裂解液、小麥胚芽和HeLa細胞的平臺。這些平臺已被用于各種應用并在CFPS領域確立可用性和多功能性方面經受了時間的考驗。

（1）教育

CFPS系統的開放性質和由此產生的直接操縱細胞機器為基于探究的學習提供機會，這點使CFPS特別適合于教室。CFPS技術在教育中的第一個應用是BioBits套件，它對不同年齡的學生進行了測試。這些套件提供了多功能的實驗選擇并且相對便宜（一個班級大約$100）。Bio Bits Bright和Explorer工具包代表了可以啟用CFPS的課堂實驗和應用程序的多樣性，熒光蛋白的產生，水凝膠的產生以及水果DNA的鑒定。這些可能性表明，CFPS可以提供一種動手的方式來探究性地學習生物化學概念。

（2）翻譯后修飾（PTMs）

翻譯后修飾（PTMs）可以極大地影響蛋白質的折疊、活性和穩定性，這可能是治療蛋白、膜蛋白和病毒樣顆粒所必需的。因此在選擇CFPS平臺時，在感興趣的蛋白質中進行各種翻譯后修飾（PTMs）的能力是一個關鍵的考慮因素。具有內源性微粒體的平臺顯示出更大的支持PTM能力。這使得像中國倉鼠卵巢、HeLa和昆蟲這樣的平臺很適合這種應用，因為內源性微粒體是由內質網形成的，并在這些提取物的制備過程中得到保留。然而，當利用內源性微粒體時，就在系統中引入了一個新的“黑盒”，限制了用戶的控制，并將PTMs的選擇限制在那些固有細胞系中。

一些PTMs可以在大腸桿菌CFPS中實現，但由于缺乏內源性微粒體和在桿菌中可能的PTMs數量有限，使這種應用與真核生物相比通常在技術上更具挑戰性。然而，大腸桿菌的利用在總體蛋白質產量和提取物制備方便方面仍然是有利的，這促使了PTMs在這個平臺上的發展。 反應的開放性使用戶能夠調整氧化還原條件，使二硫鍵的形成在該平臺可行。

（3）高通量篩選

實現高通量蛋白質生產的能力是CFPS的一個主要優勢，因為它使快速生產和篩選各種蛋白質產品的速度遠遠快于體內蛋白表達模式。耦聯CFPS允許直接插入DNA模板，而不需要細胞轉化/轉染，在某些情況下可以不做純化直接進行蛋白質產品的檢測，創造一個強大的一鍋系統。高通量CFPS的一個關鍵應用是功能基因組學，它允許闡明新的基因及其相應的蛋白質功能。高通量篩選可以在任何平臺上進行，但最常見的是利用大腸桿菌、小麥胚芽和兔網織紅細胞提取物。

（4）病毒樣粒子

病毒樣粒子（VLPs）是缺乏基因組物質的病毒的衣殼，這意味著它們是一個高度組織和對稱的蛋白質聚集體，能夠在其中攜帶感興趣的分子。因此，VLPs的生產允許研究病毒組裝，創建有效的疫苗，使用封裝輸送藥物以及材料科學方面的應用。雖然VLPs可以在體內產生，但在CFPS平臺上的生產提供了優勢，包括合成有毒的VLPs和操縱反應的氧化還原條件形成熱力學穩定所必需的合適的二硫鍵。CFPS反應的多功能性還允許一個能夠生產許多類型VLPs的單一的、更強的平臺，在一個比體內條件下可伸縮的更高產量和更容易修改的反應設置平臺來實現。

（5）大規模生產

實現CFPS的演示從高通量規模的到制造規模擴大了該平臺的效用。 有興趣利用這個應用能力的用戶用CFPS生產抗體和工業酶等，以及將CFPS工具包用于現場或教育用途，這些用戶應考慮在整個流程中擴大其規模的技術細節。這首先是細胞生長的能力，以及規模化提取物的制備，能夠實現這種規模的平臺包括大腸桿菌、小麥胚芽兔網織紅細胞。

（6）膜蛋白

膜蛋白的研究是蛋白質組學的一個重要組成部分，因為它們在生物體中具有很高的豐度。大約25%的測序基因編碼把自己整合到細胞膜上的輸水蛋白。膜蛋白在細胞內有很多功能，包括細胞識別、免疫應答、信號轉導和分子轉運。但是在體內以正確的構象表達這些完整的蛋白質往往是一個挑戰，因為在表達過程中自然豐度低，疏水性高，必須轉運到膜上，這會影響宿主細胞膜的完整性。

CFPS平臺能夠通過非膜結合系統避免依賴細胞膜的結構完整性來規避這些挑戰。此外，在提取物制備過程中，微粒體、囊泡狀結構或內質網片段（內源性微粒體）的存在允許膜蛋白正確折疊和結合，在蛋白質合成過程中蛋白質本身進入這些結構。也就是說HeLa、中國倉鼠卵巢和昆蟲平臺都含有內源性微粒體它是在由提取物制備過程中的內質網破裂形成的。這些平臺已經成功地表達了許多膜蛋白，從雙跨膜瘧疾蛋白（HeLa）到表皮生長因子受體蛋白質（中國倉鼠卵巢），最后到KcsA鉀離子通道（昆蟲）。

（7）抗體

利用CFPS在體外生產功能性抗體和抗體片段具有簡化抗體生產過程以更快速制造的潛力。這個優點部分是由于系統開放，它可以很容易地應用快速設計-構建-測試循環和修改氧化還原潛力，從案例到案例地進行修改以生產活性抗體。家兔網織紅細胞、大腸桿菌、中國倉鼠卵巢、小麥胚芽和昆蟲平臺都已經能產生抗體。

2.3 低采納平臺

迄今為止，低應用程度的無細胞平臺包括來自粗糙鏈孢霉、鏈霉菌、納氏弧菌、枯草芽孢桿菌、煙草、擬南芥、假單胞菌、大芽孢桿菌，古細菌和利什曼原蟲的平臺。這些平臺被定性為低采納平臺，因為每個平臺發表的論文少于25篇。

對該平臺進行優化的目的是用于表達高GC含量模板，以便在體外生產天然基因簇。隨著新的基因組挖掘技術，對天然產物基因簇的認識正在迅速增加。然而，在體內表達這些簇會導致非常低的可溶性產量，因為其對細胞有代謝負擔。基于鏈霉菌的CFPS不僅為更高GC含量模板的密碼子優化提供了一個機會，也為天然產物基因簇的可溶性表達提供了一個機會。

3結束語

高采納已經得到了最好的優化，并且有豐富的文獻來支持。高采納平臺包括大腸桿菌、昆蟲、酵母、中國倉鼠卵巢細胞、兔網織紅細胞，小麥胚芽，和海拉細胞。它的應用包括教育、翻譯后修飾、高通量表達、類病毒粒子生產、大規模合成、膜蛋白以及難以合成的蛋白質（抗體、大蛋白、冰結構蛋白和金屬蛋白），以及其他各種應用（翻譯機制、遺傳密碼擴展、代謝工程和遺傳線路的研究等）。本文還簡要介紹了低采納平臺所啟用的應用，包括鏈霉菌等。雖然這些平臺有一些工作支持它們的使用，但它們通常只被少數人使用，沒有經過很多優化。如果對這些平臺做更多的工作，仍然可能為該領域提供一些關鍵優勢。

參考文獻

[1] 高偉，卜寧，盧元.無細胞體系非天然蛋白質合成研究進展[J].生物工程學報，2018，34（9）：1371-1385.

[2] 張米，趙國琰，戴美學.無細胞蛋白質合成系統的研究進展及應用前景[J].生命科學，2018，30（1）：94-99.