納豆激酶溶栓功效與酶活測定研究進展

李五林

【摘 ?要】納豆是日本傳統發酵食品，納豆含有多種活性成分，其中納豆激酶對于血栓的去除有極強的功效，但納豆在中國的的推廣進展緩慢，民眾對于納豆的結構、功效、酶活的判定等不夠了解。本文概述了納豆激酶的結構特性，納豆激酶的溶栓機理、抗血栓實驗效果與酶活力的測定方法，并對納豆激酶的研究做出展望，以期增進公眾對納豆激酶的認知，并為進一步的研究奠定基礎。

【關鍵詞】納豆激酶;結構;抗血栓效果;酶活性測定方法

1 引言

血栓類疾病對患者的個人生活影響極大，如中風患者常常突然昏倒、言語障礙或失語、偏身麻木甚至半身不遂，心肌梗塞容易造成心臟驟停、心源性休克甚至心臟破裂。根據世界衛生組織WHO統計，截止2018年，我國以血栓為主要誘因的心血管病患者數量達2.9億，其發病死亡總數占居民總死亡數的40%，而在全球，直接或間接由血栓栓塞類疾病造成的死亡人數已達總死亡人數的51%，遠高于癌癥等其他疾病。因此抗血栓成為了公眾和科學界關注的焦點問題，而直接具有溶栓作用的相關生物酶的研究也成為了領域熱點。目前已開發應用的生物溶栓酶有鏈激酶和尿激酶兩種，但其皆存在不可避免的缺陷。鏈激酶易激活全身纖溶系統，造成人體纖維蛋白原含量大幅下降和全身出血，同時鏈激酶存在抗原性，部分病人會產生過敏反應。尿激酶是我國最主要的抗血栓藥物，但其對血栓骨架纖維蛋白特異性較低，不專門溶解血栓纖維蛋白，存在出血傾向，同時給藥劑量難以控制，另外尿激酶價格昂貴，而血栓患者往往需要長期服藥，絕大部分患者根本無法承受。1987年，日本須見洋行博士靈光一現，想到其本土食品納豆的發酵過程中降解的主要物質為纖維蛋白，而這正是血栓的核心骨架成分。在后續實驗中，他果然發現了一種有極大溶栓活性的物質，其活性相當于尿激酶的四倍之多，須見洋行將其命名為納豆激酶。此后，一系列關于納豆激酶更深入的研究得以展開，結果表明，納豆激酶的溶栓活性大大高于已有生物酶，同時其具有溶栓特異性，專一降解血栓骨架中的纖維蛋白，引起出血風險極低。同時其價格低廉、穩定性好、對人體安全性高，有望替代已有生物酶，從而受到更廣泛關注，日本更是倡議國民從小學起便開始堅持食用納豆。本文從活體抗血栓實驗、結構與生化特性、溶栓機理和活力測定方法幾個方面對納豆激酶的相關研究進行系統總結，并對一些問題進行分析，以期更全面的了解納豆激酶，為后續進一步的研究奠定基礎。

2納豆激酶的結構與生化特性

2.1 納豆激酶的結構

納豆激酶（Nattokinase簡稱NK）又名枯草桿菌蛋白酶NAT，屬堿性絲氨酸蛋白酶，由枯草桿菌所屬的納豆菌代謝時所分泌，在細胞外進行降解作用。酶分子為單鏈多肽，無二硫鍵，共含275個氨基酸，分子量為27.7 kDa。其與底物結合的中心由三個氨基酸（Ser125、Leu126、Gly127）構成，催化活性中心為（Asp32、His64、Ser221）。其與枯草桿菌蛋白酶E在氨基酸序列的同源性達99.5%，僅僅在85和192位的氨基酸殘基存在差異，與枯草桿菌蛋白酶BPN的同源性達86%，但除NK外其他枯草桿菌蛋白酶均未發現纖溶活性，分析原因可能與蛋白質的三級結構差異有關。2010年，NK的X-射線晶體結構被發現，如圖1。由晶體結構分析得出，NK中存在7個α-螺旋結構和9個β-折疊結構，它們相互交錯，呈現出NK整體的球狀結構，其活性位點位即于球狀蛋白表面的溝槽內。另外，

NK結構中存在2個Ca2+結合位點，與蛋白質三級結構的穩定性有關。在NK肽鏈中還存在發光氨基酸色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸，能為蛋白質的光譜研究提供基礎。

2.2 納豆激酶的生化特性

NK適宜pH為5-12，最佳pH為7-9，適宜溫度為60 oC以下，最佳溫度為35-45 oC，而人體血液pH 約為7.35-7.45，血液溫度近似37.5-38 oC，這與NK的最佳環境極其一致，十分有利于NK表現最佳活性。但酸性環境和高溫都會讓NK迅速失活，因此一般納豆激酶產品利用腸衣包裹，避免其受到胃酸破壞，另外，有研究表明，單純食用納豆時，其中的納豆激酶在納豆粘液、食物中的蛋白質、油脂等物質的包裹下，能在酸性環境中仍保持部分活性。低溫對NK的影響不大，在-20 oC的環境下，反復凍融NK五次，其仍存留95%以上的活性。因此低溫冷藏可以作為納豆的有效儲存方式。經Svunsson柱型電泳法，等電聚焦測定出NK的等電點為8.6±0.3，為NK的分離純化奠定了基礎。金屬離子對NK活性有一定影響，Na+、K+、Mg2+、Co2+、Ca2+、Tb3+等能提高其活性，Cu2+、Hg2+、Zn2+、Fe3+、Al3+則會不同程度的抑制其活性。這可能與金屬離子影響了NK的聚集性質有關。

3 納豆激酶的溶栓機理

正常人體存在對立調控的凝血溶血系統，凝血系統保證血管壁破裂時及時填堵，溶血系統則保證血液暢通。當凝血系統過強或溶血系統過弱時，便會形成血栓。當人體血因外部物理因素等造成血管內皮損傷后，體內凝血系統激活，激活各種凝血因子，使血小板大量聚集，同時促進纖維蛋白原轉化為纖維蛋白，并形成交聯結構作為血栓骨架，與聚集的血小板一起最終構成血栓。人體內部的纖溶酶是唯一能降解纖維蛋白從而促進血栓溶解的物質，大多數溶栓藥物如尿激酶、鏈激酶等皆通過促進纖溶酶的形成發揮溶栓作用。而納豆激酶除激活纖溶酶發揮作用外，還能直接作用與交聯纖維蛋白，發揮溶栓作用。NK作用機制見圖2，主要有四種途徑：a，直接刺激血管內皮細胞，促進纖溶酶前體的調控因子的釋放，間接促進纖溶;b，抑制a途徑中調控因子的抑制因子，避免纖溶受到阻礙;c，刺激尿激酶前體轉化為尿激酶，再由尿激酶激活纖溶酶前體轉化為纖溶酶，以此促進纖溶;d，直接作用于纖維蛋白，降解血栓骨架，完成纖溶，這也是NK最主要的作用途徑。

4 活體抗血栓實驗效果

4.1 直接抗血栓實驗

研究者通過大鼠靜脈直接注射納豆激酶，發現NK具有明顯溶栓效果，且溶栓活性為血纖維蛋白溶酶的4倍以上。在小鼠頸部動脈注射醋酸生成血栓的實驗中，分別靜脈注射等摩爾數的納豆激酶、纖溶酶及彈性蛋白酶，1h測定的小鼠血流再通率分別為（62.0±5.3）%、（15.8±4.5）%及0%，NK的血流再通率大大高于纖溶酶和蛋形蛋白酶，且絕大部分實驗組實現血流再通，體現了NK極高的體內溶栓活性。

另外，在突發性血栓實驗中，NK表現出了極佳的預防功效。研究者通過腸衣包裹納豆激酶口服給藥，確保其直達腸道吸收，持續進藥15000IU/Kg/d，7天后通過FeCl3誘導模仿突發性血栓，比較實驗組和生理鹽水給藥的對照組的血栓重量（2.8mg）發現，實驗組的突發性血栓重量（1.4mg）大幅度降低，表明NK能有效抵抗和減緩突發性血栓的形成。

4.2 間接抗血栓實驗

在研究小鼠對納豆激酶的腸道吸收實驗中，通過小鼠十二指腸給藥，在3-5h后即在血液中檢測到納豆激酶，表明NK可經腸道吸收。研究者以大鼠為實驗動物研究NK的體內溶栓作用底物，發現納豆激酶發揮作用時直接降解血栓骨架-交聯纖維蛋白，但對纖維蛋白前置物纖維蛋白原不敏感，這種直接作用十分有利于NK發揮其溶栓效果，且不易引起出血傾向。以大鼠為實驗動物研究NK的抗動脈粥樣硬化作用實驗中，在大鼠血管內皮損傷的前三周到后三周持續給與與含NK的納豆提取物，比較血管損傷開始和三周后的血管內膜/中層厚度值，發現實驗組（0.06±0.01）較對照組（0.15±0.03）數值明顯減小（P<0.05），且尤球蛋白凝塊溶解時間縮短，這表明NK能有效抑制大鼠血管壁血栓的形成。

另有研究者利用血液中的血栓骨架-纖維蛋白的降解產物D-dimmei和FDP的含量表征納豆激酶的抗血栓效果，通過注射角叉菜膠在小鼠體內形成血栓，再將納豆激酶分低、中、高劑量組連續灌胃一周，同時設置生理鹽水對照組，結束后取腔靜脈血分析血液中FDP、D-dimmer濃度。結果顯示，低劑量組FDP、D-dimmer含量與對照組相近，未表現明顯差異，而中劑量、高劑量組FDP、D-dimmer含量分別為對照組的2倍和3倍多，差異明顯。這表明中高劑量的納豆激酶降解了血栓，有很好的抗血栓療效，且其抗血栓作用表現出明顯的劑量效應關系。

4.3人體臨床效果

通過對心血疾病患者的研究發現，納豆激酶能夠降低患者出現心肌缺血的概率，減小心機梗死的面積。在一項志愿者參與的實驗中，研究者利用腸溶膠囊給藥避免NK受到胃酸腐蝕，對照組服用煮熟大豆，對比實驗組和對照組的優球蛋白溶解時間（ELT）、溶解活性（EFA）和纖維蛋白降解產物（FDP），結果表明實驗組志愿者血液中ELT明顯縮短，EFA大大提高，同時FDP顯著增加增加，這表明NK促進了人體中血栓的降解，顯現出較強的抗血栓活性。2015年，國家藥品批準納豆激酶作為一種功效成分上市，納豆激酶得到官方認可，繼而市場上出現大量納豆激酶產品，其中以膠囊、軟膠囊、微囊等最為多見。其利用腸溶外衣結構，避免納豆激酶受到胃部極酸環境（pH約 0.9-1.8）的破壞，從而保證NK有效的腸道吸收。

5 納豆激酶活力的測定方法

納豆激酶活力測定主要基于其三種特性，纖溶特性、降解特定枯草桿菌底物特性和抗原特性。相應其活力測定主要有三類方法：a，通過溶解模擬血栓的纖維板從而形成溶圈，比較樣品溶圈面積和標準酶溶圈面積，根據面積與活力關系得到樣品酶活的纖維板法及其改進的各種方法;b，通過直接降解幾種特定底物，根據生成產物的速率定義得出酶活，產物定量方式有表觀明顯現象如氣泡、通過產物測定吸光度或經顯色反應后測定吸光度等;c，根據NK的抗原特性用特異性抗體捕獲，與另一抗體二次結合后以過氧化物酶與二次抗體的反應確定一次結合的抗體量，進而確定NK的活力的酶聯免疫吸附法。

5.1 纖維板法及其改進

作為NK發現者驗證其纖溶活性的經典方式，纖維板法及其改進的各種活力測定方法能直接反應NK的纖溶活性，且其操作簡單易行，并可以同時測定多種樣品，因此是目前最為常用的NK活力檢測方法。該方法利用凝血酶與牛纖維蛋白原反應，在平板中生成纖維蛋白，打孔后將一定體積適宜酶活的樣品酶注入孔內，37 oC恒溫孵育18h測定溶圈面積，再將溶圈面積帶入面積-酶活標準曲線中計算樣品酶活。其中標準曲線的建立方法為：配置不同濃度的尿激酶，再分別于纖維平板中恒溫孵育出對應的不同溶圈面積，面積與酶活成線性關系，從而得到溶圈面積-酶活標準曲線。此法也存在許多缺陷，由于溶圈面積是表觀值，而一般形狀又不完全規則，因此受個人測量誤差影響較大，而溶圈面積受孵育條件與酶純度干擾，孵育時間、溫度、孵育平板、酶雜質都會對溶圈面積造成影響。另外，纖維平板所用纖維蛋白原價格昂貴，實驗成本較高。這些因素導致纖維板法數據波動性大，且具有一定人為主觀性，難以多次重復等問題。

纖維板法的改進主要有：a，增加瓊脂糖基底的瓊脂糖-纖維板法;b，增加聚丙烯酰胺基底并用特定模具代替玻璃或塑料皿，輔以指示劑放大蛋白降解效果的聚丙烯酰胺纖維蛋白膠板法;c，直接測定纖維蛋白形成初始加入NK前后，吸光度變化的血清板法。增加瓊脂糖基底能有效避免塑料平皿底部差異和不平現象，且有效減少纖維蛋白用量，聚丙烯酰胺和特定模具則進一步提高了制板精度，能一定程度提高數據穩定性。血清板法在血清板小孔中形成微型血栓，在加入NK反應前后測定OD655，操作更加簡便快捷，但一般紫外分光光度計無法直接測定血清板樣品，設備要求較高。

5.2通過降解特定底物確定酶活的方法

NK作為一種纖維蛋白降解酶，可以作用于纖維蛋白，同時NK屬枯草芽孢桿菌，能降解部分適應于枯草桿菌蛋白酶的底物，如四肽底物、甲基苯磺酸-L-精氨酸甲酯（TEAM）、酪蛋白等，根據底物命名的方法對應為纖維塊溶解時間法（CLT）、四肽底物法、TEAM法和酪蛋白法。

以纖維蛋白為底物的CLT法能粗略測定NK酶活，是纖溶酶、尿激酶等抗血栓酶常用的酶活測定方法。在37 oC恒溫水浴環境下，利用凝血酶與一定量纖維蛋白原生成纖維蛋白，從加入酶后體系產生氣泡起，到無氣泡冒出作為樣品反應時間。先測定已知活力的不同尿激酶對應的溶解時間，得到酶活-溶解時間標準曲線，再測定酶樣品的溶解時間，帶入標曲中得出酶活。此法方便快捷，但是精度較低，同時無法同時測定多個樣品。

四肽底物法源于與NK同源性達99.5%的枯草桿菌蛋白酶E的活力測定方法，NK能將人工合成的小分子四肽Suc—Ala—Ala—Pro—Phe—pNA水解生成顯色物質對硝基苯胺（p-NA），在410nm出測定吸光度，根據p-NA生成的量得出NK活力。該方法簡便迅捷，精度較高，但不能完全反映纖溶活性。

TEAM可被NK切割生成甲醇，甲醇被高錳酸鉀氧化為甲醛，后能與變色酸在沸水中發生顯色反應，產物在574nm處有強吸收，根據吸光度和反應關系從而得出NK樣品酶活。此法操作簡便、靈敏度高，但易受樣品中雜質的影響，另外其酶活結果不能完全代表纖溶活性。

酪蛋白法來源于經典的枯草桿菌蛋白酶活力測定方法，NK與酪蛋白40 oC水浴生成酪氨酸，酪氨酸與福林酚試劑30 oC下能發生顯色反應，產物在680nm處有強烈吸收，以已知不同濃度的酪氨酸與福林酚反應，得到濃度吸光度標準曲線，再由酶活定義得出酶活-吸光度標準曲線，由最終吸光度即可得出NK樣品酶活。該法簡便易行、靈敏度高、可同時測定多個樣品等，同時有研究表明此法得出的酶活結果與纖溶活性呈現一定的線性關系，故此法有望成為新的NK活力檢測方法。但由于NK特殊性，此法實際應用于NK時也存在一些問題，如酶樣品中雜質的影響等。

5.3 酶聯免疫吸附法（ELISA）

根據NK的抗原性分別制備其單克隆和多克隆抗體，先將NK與單克隆抗體結合，將多克隆抗體與過氧化物連接，再將NK結合體與多克隆復合體結合形成類似三明治的結構，過氧化物酶能與底物發生反應，生成顯色產物，在490nm出有強吸收，有吸光度即可確定NK樣品的活性。此法靈敏度極高，但操作極為繁瑣，價格昂貴，自報道以來未見后續研究。

6 結論與展望

到目前為止，納豆激酶的抗血栓效果已經得到了初步的驗證，在小鼠、犬、兔等模型中觀察到了明顯的溶栓效果，在人體臨床實驗中也得到了積極的從側面反映的抗血栓療效，但缺乏更直觀的臨床實驗結果，鑒于血栓疾病的長期性，外界環境因素的復雜性，這可能是極具挑戰性的問題。NK結構特征和作用機理已經基本明晰，基因工程研究正嘗試使NK在植物或者其他機體中直接表達出來，同時優化改進其基因以期得到更強更適應于人體的抗血栓產品。NK具體活力的測定已經有較多依據，市面上的相關產品也十分豐富，NK正越來越為人們熟知，有望為更多血栓疾病患者帶來希望。

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