車前草水提取物對糖尿病腎病大鼠腎纖維化及p38 MAPK/過氧PPAR-γ通路的影響

張凱，趙龍

牡丹江醫學院附屬紅旗醫院藥學部，黑龍江 牡丹江 157000

在糖尿病患者中糖尿病腎病是較為常見的微血管并發癥，系膜增生與基底膜增厚是其主要的病理結構特征，最終能夠導致腎小球硬化以及腎間質纖維化情況出現，嚴重威脅患者身體健康及生命安全[1]。P38是絲裂原活化蛋白激酶(簡稱MAPK)家族的重要成員之一，并在糖尿病腎病發生以及發展中具有至關重要的作用，同時在細胞外基質纖維化等諸多生理及病理過程中均有參與[2]。相關研究顯示，機體內的高糖情況還能夠誘導腎小球系膜細胞內的過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(簡稱PPAR-γ)出現表達降低情況，從而導致胞外基質由于降解減少而出現堆積情況，系膜增生后能夠導致腎小球硬化情況出現，進而導致糖尿病腎病的發生[3-4]。據臨床實踐顯示，車前草具有較好的祛痰、利尿以及明目等效果，許多國家將其作為保健食品的原料以及傳統藥草進行應用[5]。本研究通過對糖尿病腎纖維化大鼠采用車前草水提取物治療，從而探討對p38 MAPK/過氧PPAR-γ通路的影響。報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 實驗動物 選取2018年1月—2018年12月在某醫學動物實驗中心飼養的60只大鼠[動物生產許可證：SCXK(廣)2008—2009]作為本研究對象。大鼠體重為160～180g，平均(170.4±11.8)g，均對所有大鼠進行1周的適應性喂養，濕度40%～60%，溫度(23.2±1.8)℃，動物造模前自由進水，但禁食12h，該研究符合相關的動物倫理學要求。

1.1.2 實驗用藥物 將100g車前草采用純水浸泡20min，之后采用100mL水進行2次煎煮，待煮沸后采用文火煮30min，合并2次藥液后經蒸發濃縮至100mL，其中含1g/mL的生藥量，最后冷藏備用。

1.2 方法

1.2.1 動物模型 將50只大鼠采用高脂高糖喂養與65mg/kg的鏈脲佐菌素經單次腹腔注射的方式建立糖尿病腎病大鼠模型。并將剩余的10只大鼠作為對照組，并給予其等量的檸檬酸鹽溶液注射。在鏈脲佐菌素注射后的第3天與第7天分別采集大鼠的尾靜脈血進行血糖值檢測，若連續兩次的血糖值均 ≥16.5mmoL/L則為模型制備成功。

1.2.2 分組與給藥 在造模成功1周之后，取造模成功的40只大鼠隨機分為車前草低劑量組、高劑量組，陽性藥物組與模型組，各10只。其中，車前草低劑量組與高劑量組的給藥分別為1.15g/kg、4.64g/kg；陽性藥物組，纈沙坦(生產廠家：北京諾華制藥有限公司，國藥準字H20173014)4.8×10-3g/kg，每天經灌胃給藥1次，給藥體積約為1mL/次。此外，對照組與模型組均按照體重給予等體積的生理鹽水灌注，連續灌注及給藥12周。

1.3 觀察指標

(1)生化指標檢測。在用藥12周后，分別對大鼠的空腹血肌酐(serum creatinine,Scr)與血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)水平進行測量，并將大鼠置入代謝籠內，收集其24h的尿液，取其上清液對其24h尿蛋白含量進行檢測。

(2)在治療12周后對各組大鼠進行血清中腎纖維化相關指標的檢測，采用酶聯免疫吸附法進行檢測，檢測指標主要包含大鼠半胱氨酸蛋白酶抑制劑/胱抑素C(CysC)、基質金屬蛋白酶抑制劑抑制因子 1(tissue inhibitors of metalloproteinase 1,TIMP-1)、轉化生長因子β1(transforming growth factor 1,TGF-β1)。(3)檢測并比較各組大鼠腎組織的相關指標，主要包含P38 MAPK、P-P38 MAPK及PPAR-γ的表達水平，具體為：①HE染色，在給藥12周之后將大鼠采用頸椎脫臼方法處死，經腹腔將其左腎取出，并沿腎臟矢狀面將其一分為二。之后將其中一半腎臟放入濃度為10%的中性甲醛中進行固定，并做常規的脫水處理，在進行石蠟包埋后用作HE染色；同時將另一半放入液氮中進行凍存。將大鼠的腎組織標本切為5μm厚度，為避免出現脫片情況，對其進行2h的60℃烤片，在HE染色后置于光鏡下進行仔細觀察，并進行相應的組織病理學檢測。②Western blot分析，將在液氮中保存的腎組織取出，并經充分研磨后將適量的蛋白緩沖液加入其中，依據常規方法進行蛋白提取，并利用BCA法定量進行相應的濃度調節。之后去50μg的蛋白樣品，經SDS-PAGE電泳后轉至硝酸纖維素膜，將其浸入濃度為5%的脫脂奶粉中并進行1h的避光封存；經洗滌后浸入一抗稀釋液當中，其中P38 MAPK、P-P38 MAPK及PPAR-γ的具體稀釋比例為1:1000，之后放入4℃的環境中孵育過夜，次日清晨進行第二次洗滌，之后浸入二抗稀釋液當中，比例為1:5000，再經1h的室溫搖床孵育，洗滌采用ECL發光液進行滴加，經3次曝光，選取相應的重疊值，其中采用Image J軟件進行蛋白條帶灰度值分析，采用β-actin進行內參蛋白分析。

1.4 統計學方法數據應用SPSS21.0進行分析，其中計數資料以(例/%)表示，進行χ2檢驗，計量資料以()表示，進行t檢驗，P＜0.05提示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠Scr、BUN及24h尿蛋白含量對比模型組的Scr、BUN及24h尿蛋白含量均高于對照組、陽性藥物組及低劑量、高劑量組，且高劑量用藥物組的Scr、BUN及24h尿蛋白含量均低于低劑量用藥組(P＜0.05)，具體見表1。

表1 比較各組大鼠的Scr、BUN及24h尿蛋白含量()

表1 比較各組大鼠的Scr、BUN及24h尿蛋白含量()

2.2 大鼠血清纖維化的相關指標各組大鼠的CysC、TIMP-1及TGF-β1指標差異有統計學意義(P＜0.05)，且高劑量用藥組的各項指標均低于低劑量組(P＜0.05)，具體見表2。

表2 比較各組大鼠血清腎纖維化的相關指標()

表2 比較各組大鼠血清腎纖維化的相關指標()

2.3 大鼠腎組織P38 MAPK、P-P38 MAPK及PPAR-γ表達水平對比各組大鼠的P-P38 MAPK及PPAR-γ水平差異有統計學意義(P＜0.05)，且高劑量用藥組的P-P38 MAPK水平低于低劑量組，而PPAR-γ水平高于低劑量組(P＜0.05)，各組的P38 MAPK水平差異無統計學意義(P＞0.05)，具體見表3。

表3 比較各組大鼠腎組織P38 MAPK、P-P38 MAPK及PPAR-γ表達水平()

表3 比較各組大鼠腎組織P38 MAPK、P-P38 MAPK及PPAR-γ表達水平()

3 討論

糖尿病腎病是糖尿病患者中較為嚴重的并發癥類型，當機體出現持續性蛋白尿情況時，若不采取及時有效的救治措施，則極有可能導致腎衰竭，從而對患者身體健康及生命安全造成嚴重威脅[6]。因此，積極尋求科學、有效的治療藥物對逆轉糖尿病腎病具有至關重要的作用。

本研究中通過采用脲佐菌素誘導而建立相應的糖尿病腎病大鼠模型，并經HE染色顯示，模型組的大鼠腎臟出現顯著萎縮情況，腎小管顯著擴張，系膜基質明顯增加，腎小球存在硬化情況[7]。而經車前草水提取物治療后期腎臟病變情況顯著緩解，且給藥濃度較高的大鼠其腎臟病變的嚴重情況相對較輕，從而說明在對糖尿病腎病大鼠在進行腎組織損傷修復的過程中，采用車前草水提取物治療具有較好效果[8-9]。經本研究顯示，模型組的Scr、BUN及24h尿蛋白含量均高于對照組、陽性藥物組及低劑量、高劑量組，且高劑量用藥物組的Scr、BUN及24h尿蛋白含量均低于低劑量用藥組(P＜0.05)。由此可見，采用高劑量的車前草水提取物治療能夠促使糖尿病腎病大鼠的腎功能指標得到顯著改善，并對大鼠腎功能損傷情況進行有效保護。糖尿病腎病患者在出現腎功能損傷的同時，也會伴有不同程度的腎臟纖維化情況，其主要特征為胞外基質的異常堆積[10]。血管活性物質、高血糖以及炎性因子等多種纖維化細胞因子存在的異常高表達情況及其相互之間的作用，最終導致機體出現腎間質纖維化[11]。

糖蛋白以及膠原蛋白合成代謝情況的明顯增加，從而極易導致CysC、TIMP-1及TGF-β1等與腎纖維化密切相關的指標出現異常升高情況[12]。其中，TIMP-1還與腎纖維化中的血管重塑緊密相關，而TGF-β1則是至關重要的致纖維化因子，在機體胞外基質平衡的維持中具有重要作用，同時還能夠有效調控機體的炎性反應，致使胞外基質合成及堆積情況增加，胞外基質降解的情況也得到有效抑制。綜合上述指標，它們都能對腎纖維化程度進行有效反應[13]。在本研究中發現：各組大鼠的CysC、TIMP-1及TGF-β1指標均存在顯著差異(P＜0.05)，且高劑量用藥組的各項指標均低于低劑量組(P＜0.05)。由此說明，對糖尿病腎病大鼠采用車前草水提取物治療，能夠促使CysC、TIMP-1及TGF-β1表達情況得到有效抑制，進而減緩腎纖維化進程。

P38 MAPK是MAPK中的重要家族成員，是進行細胞外信號轉導的共同通路，幾乎在生物體的整個生理及病理過程中均有參與，尤其是氧化應激以及炎性反應等[14]。P38 MAPK主要在細胞質內進行表達，在機體正常的生理狀況下其活性相對較低，經磷酸化激活后P-P38 MAPK轉移至核內，能夠磷酸化激活較多的轉錄因子，并對炎性因子等所累靶基因表達情況進行有效調控，同時與機體糖尿病血管并發癥的出現緊密相關[15]。在細胞因子表達機制的有效調控中P38 MAPK具有至關重要的作用，通過對該通路進行有效抑制能夠對促炎因子的表達情況進行有效抑制，機體炎癥反應情況得到有效緩解[16]。在本研究中經Western blot分析顯示：各組大鼠的P-P38 MAPK及PPAR-γ水平均存在顯著差異(P＜0.05)，且高劑量用藥組的P-P38 MAPK水平低于低劑量組，而PPAR-γ水平高于低劑量組(P＜0.05)，說明采用車前草水提取物能夠有效降低大鼠的P-P38 MAPK水平，而PPAR-γ水平得到有效提升。經車前草水提取物及陽性藥物干預后，與模型組比較大鼠的P-P38 MAPK水平明顯降低，且高劑量給藥組的水平相對較低，由此可見，經車前草水提取物干預后能夠有效抑制P38 MAPK的磷酸化過程[17]。

PPAR-γ屬于核因子超家族中的一員，能夠對大量基因表達所需的核受體進行有效調節，并在機體的免疫炎癥反應及糖脂代謝中發揮著至關重要的作用，高糖能夠促使腎小球系膜細胞內的PPAR-γ水平得到顯著提升，從而導致胞外基質沉積以及系膜增生情況出現，最終導致腎小球硬化以及纖維化[18-19]。對于糖尿病腎病中腎組織損傷的大鼠采用車前草水提取物能夠促使PPAR-γ表達情況得到有效激活，P38 MAPK通路得到有效抑制，腎纖維化情況得到有效緩解[20]。但由于糖尿病腎病的發病機制相對復雜，對糖尿病腎病采用車前草水提取物治療的過程中，對于其具體的作用機理還需更多的臨床研究及實踐來證實。

綜上所述，對糖尿病腎病大鼠采用車前草水提取物治療，能夠顯著降低對大鼠腎臟的損傷，腎纖維化情況顯著減輕，該情況出現的原因可能與P38 MAPK通路受到顯著抑制以及PPAR-γ通路得到有效激活的情況有關。