葫蘆蜂幼蟲褐變抑制的研究

張根生，陳曉明，2，黃國忠，陳濟寬，張紅城，2

（1. 哈爾濱商業大學食品工程學院，黑龍江哈爾濱 150076；2. 中國農業科學院 蜜蜂研究所，北京 100093；3. 龍陵縣黃氏蜂業有限公司，云南 保山 678300）

葫蘆蜂（Vespa velutinaLepeletier）[1]，又叫黃腳胡蜂。原產于中國、印度北部和東南亞的熱帶和亞熱帶地區，后來引入法國西南部，進而在歐洲各國傳播[2]。葫蘆蜂具有很高的資源價值，體現在很多方面。生態壞境方面，可以為野生植物傳粉[3]和捕食農林害蟲[4]；食用價值方面，含有豐富的營養素，亦可作為保健食品[5]；藥用價值方面，葫蘆蜂既具有抗炎作用，又具有抗衰老功效[6]。因此，葫蘆蜂的養殖、生產和銷售產業鏈正在如火如荼地構建，已經達到一定的產業化規模。但是，市售的葫蘆蜂幼蟲和蛹通常呈現黃褐色，影響消費者的購買欲望。在昆蟲中，多酚氧化酶（PPO） 是誘發黑化反應的主要酶，對于防止病原微生物入侵和傷口愈合至關重要[7-8]。昆蟲中的多酚氧化酶是3 型含銅蛋白（type 3 copper protein），該蛋白的活性中心有2 個銅結合位點，每個銅結合位點由3 個保守的組氨酸螯合銅離子形成[8]。

酶促褐變的控制主要有化學方法和物理方法2 種。化學方法按照控制機理又可分為直接抑制和間接抑制。直接抑制是指抗褐變劑直接作用于PPO 分子，通過螯合PPO 活性中心銅離子而使其失去活性，如高興祥等人[9]用曲酸抑制甜菜夜蛾中的PPO。間接抑制是指抗褐變劑與褐變中間產物或底物反應形成絡合物，從而其避免與PPO 接觸以達到抑制褐變的目的，如1 mmol/L 半胱氨酸能明顯抑制家蠶中的多酚氧化酶活性[10]。物理方法主要包括熱處理和非熱處理2 種方式。因為熱處理會導致營養成分和風味的損失，所以越來越多地用非熱處理鈍化PPO。但是非熱處理技術幾乎沒有應用在昆蟲上，而在更加常見的海產品和果蔬上應用較多。李秀霞等人[11]利用超高壓鈍化南美白對蝦的多酚氧化酶。結果表明，鈍化效果隨著超高壓壓強的增大而逐漸增大，超過350 MPa/10 min 超高壓處理能有效鈍化多酚氧化酶活性。肖建等人[12]利用高密度CO2鈍化哈密瓜汁中的PPO，處理后的PPO 酶活最大下降了約79%。

酶促褐變抑制的另外一種延伸就是物理方法結合化學方法，如超聲波聯合抗壞血酸可顯著抑制鮮切蘋果果肉褐變率及多酚氧化酶的活性，抑制率分別高達46%和98%[13]。單獨使用蘋果酸（10，20，30 mmol/L） 或超聲波處理都無法有效鈍化PPO，但兩者結合的鈍化效果明顯強于單獨使用的效果[14]。這種非熱處理聯合抗褐變劑的方法能保證食品的感官品質和營養價值，但是幾乎很少用于昆蟲。因此，采用超高壓聯合抗壞血酸抑制葫蘆蜂幼蟲中的多酚氧化酶，通過SDS 電泳和Native 電泳篩選出多酚氧化酶條帶，并對該條帶做了質譜分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葫蘆蜂幼蟲，云南省龍陵縣黃氏蜂業有限公司提供；二水合磷酸二氫鈉、十二水合磷酸氫二鈉，Sigma 公司提供；鄰苯二酚、L - 抗壞血酸，上海麥克林生化科技有限公司提供；預染蛋白Maker （NO.26616）、NativeMark （LC0725），美國Thermo Fisher公司提供；NovexR 4- 12%Tris- 甘氨酸凝膠、Novex R Tris- 甘氨酸SDS 上樣緩沖液（2x）、NovexR Tris-甘氨酸Native 上樣緩沖液（2x）、NovexR Tris- 甘氨酸SDS 電泳緩沖液 （10x）、Novex R Tris- 甘氨酸Native 電泳緩沖液（10x），Invitrogen 公司提供。

1.2 儀器與設備

AL104 型電子天平、SevenEasy 型pH 計，梅特勒- 托利多儀器（上海） 有限公司產品；Milli- Q Intergral 型超純水一體化系統，美國Merk Millipore公司產品；UP- 250 型超聲波細胞破碎機，寧波新芝生物科技股份有限公司產品；Sorvall Biofuge Startos型臺式離心機、Orbitrap Fusion 質譜儀，美國Thermo Fisher 公司產品；SY21- K 型電熱恒溫水浴鍋，北京長風儀器儀表公司產品；UV- 2550 型紫外分光光度計，日本島津公司產品；HPP.W1 系列超高壓設備，天津華泰森淼生物工程技術股份有限公司產品；DYY- 6C 型電泳儀，北京市六一儀器廠產品；XCell SureLockTM Mini- Cell and Xcell 型蛋白垂直電泳槽，Invitrogen 公司產品；IKAR C- MAG HP10 型數顯加熱板，德國IKA 公司產品；TS- 2 型脫色搖床，江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司產品；電泳圖像掃描儀，美國Bio- Rad 公司產品。

1.3 方法

1.3.1 PPO 的制備

參照Shi X L 等人[15]制備粗酶液，并稍作修改。取4.0 g 凍存的葫蘆蜂幼蟲樣品，加入20 mL 預冷的磷酸鹽緩沖液（50 mmol/L，pH 值7，溫度4 ℃） 冰浴研磨，之后迅速放入冰浴的離心管中，然后用超聲波細胞破碎機勻漿破碎2 min，勻漿液于4 ℃下浸提30 min 后于4 ℃下以轉速10 000 r/min 離心20 min，用16 層紗布過濾，上清液即為粗酶液，于- 80 ℃下備用，測定前冷水浴溶解。

1.3.2 PPO 活力的測定

參照Sadawarte A K 等人[16]的方法并略有改進。以鄰苯二酚為底物，將濃度50 mmol/L 磷酸鹽緩沖液2 mL （pH 值6.0） 與濃度20 mmol/L 的鄰苯二酚1 mL混合均勻，于30 ℃下預熱10 min，然后加入30 ℃預熱2 min的酶液200 μL，混勻后，于波長420 nm 處每10 s 記錄一次吸光度的變化，連續記錄90 s。共做3 次平行。最后，酶活力用單位時間內吸光度變化的平均值（ΔA/min） 來表征。

1.3.3 抗壞血酸對PPO 的抑制

體系中依次加入30 ℃預熱過的濃度50 mmol/L磷酸鹽緩沖液2 mL （pH 值6.0）、濃度20 mmol/L 的鄰苯二酚1 mL、不同質量分數（W/W） 的抗壞血酸100 μL （0，0.08%，0.16%，0.24%，0.32%，0.40%）和酶液200 μL，酶活力測定方法同1.3.2，空白對照組以超純水100 μL 代替抗壞血酸。酶被抗壞血酸處理前后酶活力變化以剩余酶活力表示。

式中：Ax——抗壞血酸處理后的酶活力；

A0——新鮮樣品的酶活力。

1.3.4 抗壞血酸聯合超高壓對PPO 的抑制

吸取1.2 mL 酶液裝入7 cm×12 cm 的PE 薄膜包裝袋中，用封口機熱封口。用重物栓將包裝袋放置于超高壓處理釜中，壓強設為300 MPa，時間設為5，10，15，20，25 min。處理后的樣品放入- 80 ℃備用，測定前冷水浴溶解。反應體系中依次加入30 ℃預熱過的50 mmol/L 磷酸鹽緩沖液2 mL （pH 值6.0）、20 mmol/L 的鄰苯二酚1 mL，質量分數為0.16%、0.24%的抗壞血酸100 μL 和酶液200 μL，酶活力測定方法同1.3.2，空白對照組以100 μL 超純水代替抗壞血酸。酶被抗壞血酸處理前后酶活力變化以剩余酶活力 表示。

1.3.5 非還原SDS- PAGE 電泳

參照Zhang Y 等人[17]的方法并稍有修改。將粗酶液與等體積的SDS 上樣緩沖液混合均勻，但不加熱也不加還原劑。電泳在恒定電壓（225 V） 下進行，直到溴酚藍前沿開始從凝膠中耗盡。一塊凝膠用考馬斯亮藍R- 250 染色；另一塊凝膠先在濃度50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 值6.0） 中預平衡20 min，然后加入濃度10 mmol/L 4- 甲基鄰苯二酚在30 ℃下進行活性染色。用電泳圖像掃描儀記錄染色后的結果。

1.3.6 Native 電泳

參照Del Valle Loto F 等人[18]的方法并稍有修改。將粗酶液與等體積的Native 上樣緩沖液混合均勻。電泳在恒定電壓（225 V） 下進行，直到溴酚藍前沿開始從凝膠中耗盡。一塊凝膠用考馬斯亮藍R- 250染色；另一塊凝膠切割成2 個部分，一部分先在濃度50 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 值6.0） 中預平衡20 min，然后加入濃度10 mmol/L 4- 甲基鄰苯二酚在30 ℃下進行活性染色。用電泳圖像掃描儀記錄染色后的結果。另一部分做LC- MS 質譜分析，不染色。

1.3.7 LC- MS 質譜分析

（1） 蛋白條帶脫色及還原烷基化。將Native 電泳不進行染色的條帶按照活性染色染出的條帶同位置進行切割，裝于EP 管中。首先，向離心管中加入濃度為0.025 mol/L 的DTT，常溫靜置1h 后將多余的DTT 吸出；再加入無水乙腈，脫去蛋白條帶中多余的水分，反復操作直至條帶縮小變白；除去多余的無水乙腈并進行真空干燥。然后，將蛋白條帶浸沒于濃度為0.055 mol/L的碘乙酰胺中，常溫靜置1 h 后將多余的碘乙酰胺吸出；再加入無水乙腈，脫去蛋白條帶中多余的水分，反復操作直至條帶縮小變白，除去多余的無水乙腈并進行真空干燥。

（2） 蛋白條帶酶解。將烷基化的蛋白條帶浸入25%的甲酸中，然后加入胃蛋白酶，放入4 ℃冰箱中。待蛋白條帶充分吸脹后除去多余酶液，置于37 ℃恒溫箱中消化16 h。將酶解后的肽段用質量分數1%三氟乙酸和質量分數50%丙酮的萃取液200 μL 于37 ℃下萃取1 h，收集上清液置于新的EP 管中；重復萃取2 次，并將收集的上清液合并，最后將上清液經真空離心蒸發濃縮器濃縮至大約40 μL。

（3） 蛋白條帶的質譜分析。將收集的上清濃縮液裝入新的EP 管中，于4 ℃下以轉速12 000 r/min離心10 min，取上清液30 μL 用于質譜分析。儀器為Easy- nLC 1000 與Orbitrap Fusion 質譜耦合；色譜柱為Acclaim PepMap C18色譜柱 （100 μm×2 cm，3 μm）；流動相A 為質量分數0.1%甲酸的超純水，流動相B 為質量分數0.1%甲酸的乙腈；流速為300 nL/min，運行時間為60 min。模式為陽離子模式，Veap 1 900 V；干燥氣溫度為300 ℃；干燥氣流速為2.5 L/min；分液器電壓為65 V；碎裂電壓為175 V。結果用Protepme Discoverer(Version PD1.4)軟件進行數據庫比對。

2 結果與分析

2.1 抗壞血酸對多酚氧化酶活力的影響

抗壞血酸對多酚氧化酶活力的影響見圖1。

由圖1 可知，抗壞血酸可以顯著抑制葫蘆蜂幼蟲PPO 的活力，不同于核桃扁葉甲[19]對抗壞血酸抑制的不敏感性。總體上PPO 活力隨著抗壞血酸質量分數（W/W） 的增加而降低。當抗壞血酸質量分數為0.08%時，PPO 的剩余活力基本沒有變化。但隨著抗壞血酸質量分數的進一步增加，PPO 的剩余活力則下降明顯。當抗壞血酸質量分數達到0.40%時，酶活被完全抑制，IC50值為0.190 6%。

抗壞血酸是一種強還原劑，可把中間產物鄰苯二醌還原成鄰二酸和脫氫抗壞血酸，阻止了中間產物進一步聚合成黑色素。但是，由于抗壞血酸抑制褐變的途徑并不直接針對于PPO 本身，一旦溶液中的抗壞血酸被消耗殆盡，醌類物質又會重新聚集[20]。因此，抗壞血酸抑制褐變的有效性與溶液中抗壞血酸的質量分數直接相關。

2.2 抗壞血酸對葫蘆蜂pH 值的影響

抗壞血酸對葫蘆蜂幼蟲pH 值的影響見表1。

表1 抗壞血酸對葫蘆蜂幼蟲pH 值的影響

由表1 可知，抗壞血酸能很好抑制葫蘆蜂幼蟲PPO 的活力，但是高質量分數的抗壞血酸也會影響幼蟲的pH 值。表1 顯示抗壞血酸添加量超過0.24%時，pH 值會降到6 以下，導致葫蘆蜂系列產品的口感過酸。而且pH 值在等電點附近時，蛋白質溶解性較低。采用堿溶酸沉法測得蛋白等電點大約4.0。因此，綜合以上因素，選取質量分數為0.16%的抗壞血酸聯合超高壓進行試驗。

2.3 抗壞血酸聯合超高壓對PPO 活力的影響

抗壞血酸聯合超高壓對PPO 活力的影響見圖2。

由圖2 可知，質量分數為0.16%的抗壞血酸聯合超高壓能使葫蘆蜂幼蟲PPO 活性顯著下降。且經過超高壓處理的都低于起始時間的酶活，這表明抗壞血酸聯合超高壓比單獨使用抗壞血酸處理效果好。處理5 min 時，相對酶活降至10.89%；處理10 min時，相對酶活降至4.26%；處理15 min 時，剩余酶活僅剩1.47%。

2.4 非還原SDS 電泳及Native 電泳

PPO 的SDS- PAGE 和Native- PAGE 圖見圖3。

非還原性SDS- PAGE 凝膠用考馬斯亮藍R- 250蛋白染色（圖3 （a）），結果顯示蛋白條帶集中分布在15～55 kDa，但是這些條帶是彌散帶；另外，在70 kDa 有2 條，120，180，260 kDa 各有1 條明顯的條帶。用4 - 甲基鄰苯二酚染色（圖3 （b）），結果顯示葫蘆蜂PPO 的分子量約為120 kDa，高于果蠅 （60 kDa）[21]、埃及伊蚊 （50 kDa）[22]和家蠶（81 kDa）[23]。 Native- PAGE 凝 膠 用 考 馬 斯 亮 藍R- 250 蛋白染色 （圖3 （c）） 結果與非還原性SDS- PAGE 凝膠條帶分布相似。用4 - 甲基鄰苯二酚染色（圖3 （d）），結果顯示PPO 的分子量約為720 kDa，表明葫蘆蜂PPO 為亞基120 kDa 的多聚體。

2.5 LC- MS 質譜分析鑒定

LC- MS 質譜分析圖見圖4。

為精確鑒定PPO，采用LC- MS 進行分析。膠上蛋白經胃蛋白酶酶解后，將蛋白質多肽片段進入LC- MS 進行質譜分析。所得質譜結果經NCBI 數據庫檢索后， 得出的匹配蛋白為胡蜂屬 （Polistes Canadensis） 的多酚氧化酶 （phenoloxidase 2- like），序列號為XP_014613621.1，匹配度分值為135.25 分，覆蓋范圍為7.63%。

3 結論

抗壞血酸能有效抑制葫蘆蜂幼蟲PPO 的活力，剩余酶活隨著抗壞血酸質量分數的增多而降低，甚至在0.4%時，酶活被完全抑制。抗壞血酸聯合超高壓對葫蘆蜂幼蟲PPO 的抑制呈協同效應，幼蟲添加質量分數0.16%的抗壞血酸，并在壓強300 MPa 處理15 min，PPO 活力基本完全被抑制。通過電泳及質譜鑒定，得知葫蘆蜂幼蟲PPO 的蛋白名稱是phenoloxidase 2- like，表觀分子量大約為120 kDa。