TRIM26 在人和小鼠主要組織器官中的表達譜

廉 梅林曉琳賈俊雙肖勝軍肖 東*

(1.南方醫科大學基礎醫學院,廣州 510515；2.南方醫科大學實驗動物管理中心,廣州 510515；3.桂林醫學院第二附屬醫院病理科,廣西 桂林 541199)

TRIM(三結構域蛋白,Tripartite motif)家族蛋白具有高度保守的RBCC 結構域,由眾多的成員組成,廣泛存在于大多數動物體內,具有免疫調節和E3泛素連接酶活性,可參與機體的免疫應答過程和泛素依賴的蛋白酶體介導的蛋白質降解[1]。 大多數TRIM 蛋白由一個RING 鋅指結構域、一個或兩個B-box 結構域和一個卷曲螺旋結構域(coiled-coil,CC),又被稱為RBCC 結構域[2]。 到目前為止已經發現了70 多個人源TRIM 蛋白,它們在機體中參與了多種生物過程和疾病發病機制的調控過程。

TRIM26/ZNF173/RNF95 基因位于6 號染色體的主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex, MHC)區域[3]。 TRIM26 由一個RING 鋅指結構域、一個B-box 2 結構、一個卷曲螺旋結構域和一個PRY-SPRY 結構域[4]組成；其中鋅指結構域結合DNA,參與基因表達調控,RING 結構域具有E3 泛素連接酶的活性[5],B-box 2 結構域參與蛋白泛素化修飾調節,PRY-SPRY 結構域對免疫應答有調控作用,可以促進多聚信號復合體的形成[6]。 迄今,為數不多的研究表明,TRIM26 具有E3 泛素連接酶的活性[7],其在呼吸道疾病[8]、抗HIV-1 感染[9]和作為精神分裂癥的易感基因[10]等方面發揮著重要作用。 此外,E3 連接酶TRIM26 通過泛素化降解核內的IRF3 負向調控IFN-β 的產生和抗病毒免疫反應[11]；TRIM26 是抗RNA 病毒先天免疫反應的一個重要調節因子[12]。

最近有研究表明,TRIM26 與腫瘤有一定關系。Mule 和TRIM26 介導的NEIL1 泛素化依賴調節是細胞DNA 損傷反應所需要的,RNA 干擾沉默TRIM26 表達可增強人骨肉瘤U2OS 細胞對放療的抵抗性[13]。 TRIM26 可通過泛素化調節NTH1 參與人結直腸癌HCT116 細胞對氧化應激敏感性的調控,RNA 干擾沉默TRIM26 表達可增強對過氧化氫(H2O2)所致HCT116 細胞氧化應激損傷的保護作用[14]。 此外,RT-qPCR、基因芯片和原位雜交等研究結果顯示,TRIM26 在鼻咽癌組織中表達顯著下調；同時,基因芯片數據亦揭示,在下調最明顯的10個基因中,TRIM26 位于第4 位[15]。 新近研究亦證實,鼻咽癌組織中TRIM26 表達下調與鼻咽癌低免疫反應密切相關[16]。 總之,目前對TRIM26 在腫瘤發生、發展中的調控作用仍然知之甚少,還有待進一步的探索。

為明確TRIM26 在人和小鼠主要組織器官上的表達譜,本文通過免疫組織化學技術檢測TRIM26在正常人體和小鼠組織器官中的表達,了解該基因在不同組織上的表達定位情況,再結合BioGPS 數據庫和RT-qPCR 對TRIM26 在組織上的表達水平進行分析。 通過表達定位和表達水平的綜合分析,明確該基因在人和小鼠主要組織器官上的表達譜,將為利用TRIM26 條件性敲除小鼠解析TRIM26 在不同組織器官的功能及其在腫瘤等疾病發生發展過程的作用及其分子調控機制奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

SPF 級C57BL/6 小鼠,雌性5 只,30 ～35 日齡,體重15～17 g,購買于南方醫科大學實驗動物中心[SCXK(粵)2016-0041],飼養在南方醫科大學實驗動物中心SPF 實驗動物部[SYXK(粵) 2016 -0167]。 實驗方案通過南方醫科大學實驗動物倫理審查委員會審批(L2017068),符合3R 原則。

1.1.2 實驗組織

正常人體組織標本來自桂林醫學院第二附屬醫院病理科,取自手術切除器官病變旁正常組織(標本來源經桂林醫學院第二附屬醫院倫理委員會批準并由患者簽署知情同意書)。 肝(10 例),胃(7例),肺(6 例),結腸、胰腺、腎和脾(各5 例),食管和子宮內膜(各4 例),甲狀腺、皮膚和乳腺(各3例),腦和卵巢(各2 例)。 所有組織經病理學檢查不含癌組織。

1.2 主要試劑與儀器

無水乙醇、二甲苯、氯仿、異丙醇(天津市大茂化學試劑廠)；TRIM26 抗體(ab188017) (美國Abcam 公司)；PBS 緩沖液粉末、檸檬酸鹽修復液(pH6.0)、封閉用羊血清(工作液)、兔二步法試劑盒(內源性過氧化物酶阻斷劑、酶標山羊抗兔IgG 聚合物)、DAB 顯色試劑盒(20X)、蘇木素染色液(北京中杉金橋生物技術有限公司)；TRIzol、PrimeScriptTMRT Reagent Kit、SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa 公司)。 熒光定量PCR 儀(LightCycler?96,瑞士Roche 公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 標本處理

4%多聚甲醛溶液固定組織24 h,常規石蠟脫水、包埋、切片(4 μm)(為減少誤差,相同器官組織包埋于一個蠟塊上)。

1.3.2 免疫組織化學(immunohistochemistry,IHC)染色

選擇PV-9000 二步法(非生物素):石蠟切片經脫蠟、水化、抗原修復后,滴加一抗并4℃過夜；酶標山羊抗兔IgG 聚合物37℃孵育30 min,DAB 顯色(顯色時間控制一致),蘇木素復染,經過梯度乙醇與二甲苯脫水,最后中性樹脂封片后在光鏡觀察并拍照。 陰性對照為PBS 代替一抗。

1.3.3 免疫組織化學結果判讀

免疫組織化學染色,呈棕黃色為陽性,不著色為陰性。 結果由兩位桂林醫學院第二附屬醫院病理科醫生獨立判讀TRIM26 所表達的組織部位并評分,根據陽性信號強度不同分為0 ～3 分,分別代表TRIM26 在組織上不表達、弱陽性表達、中等陽性表達和強陽性表達,統計評分結果,確定該基因在不同組織上的表達強度。 陰性對照不著色為不表達。

1.3.4 BioGPS 數據庫分析

利用BioGPS 數據庫中的Gene Atlas U133 A,gcrma(http://biogps.org/)數據集,分析TRIM26 在人的主要組織器官中的mRNA 表達水平,并用GraphPad Prism 5 做柱形圖。

1.3.5 小鼠組織RNA 提取和實時熒光定量PCR反應(quantitative real time polymerase chain reaction,RT-qPCR)

收取小鼠主要組織器官,按說明書抽提總RNA和逆轉錄反應。 以獲得的cDNA 為模板,設計引物進行RT-qPCR 檢測。 選擇GAPDH 基因作為內參照,檢測TRIM26 的表達；選擇在小鼠組織中表達量最低的組織為1,其他組織器官按其相對表達量作圖。

小 鼠 GAPDH 上 游 引 物 序 列: 5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′,下游引物序列:5′-GGGGTCGTTGATGGCAACA-3′；小鼠TRIM26 上游引物序列:5′-TCGGCCAGTGGATACCTACAT-3′,下游引物序列:5′-TGGCTCACAGTCAAACTGCTG-3′。

2 結果

2.1 人體主要組織器官中TRIM26 的表達譜

對不同人體組織的IHC 染色結果進行評分,染色呈深棕色為強表達,不著色為不表達。 IHC 結果分析顯示,TRIM26 蛋白主要定位于細胞質中,少部分組織定位于細胞核,同一組織的表達定位在多例標本中一致(圖1)。 在食管鱗狀上皮細胞(圖1A)、胃底腺上皮細胞(圖1B)、小腸和結腸的上皮細胞(圖1C、1D)、肝細胞(圖1E)、胰島細胞(圖1F)、腦神經元和膠質細胞(圖1G)、氣管及支氣管纖毛柱狀上皮細胞(圖1H)、肺泡腔內巨噬細胞及上皮細胞(圖1I)、脾血竇內皮細胞(圖1J)、腎小管和腎球囊壁上皮細胞及腎小球細胞(圖1K)、卵巢間質細胞(圖1L)、子宮內膜腺上皮細胞(圖1M)、甲狀腺濾泡上皮細胞(圖1N)、乳腺小葉上皮細胞(圖1O)和鱗狀上皮細胞(圖1P)中TRIM26 均有表達,但在以上這些組織中,乳腺小葉上皮細胞和胰島細胞中TRIM26 表達較強。

2.2 TRIM26 在人體主要組織器官中的相對表達水平

根據BioGPS 數據庫中的Gene Atlas U133A,gcrma 數據集,以數據庫中TRIM26 表達量最低的卵巢組織為1,其它組織器官按其相對表達量作圖。TRIM26 在人的主要組織器官上的mRNA 表達量見圖2。 TRIM26 在氣管、肝和甲狀腺上的表達水平較高,并且該基因在胰島細胞上的表達量高于其在胰腺組織上的表達量。

2.3 IHC 揭示小鼠主要組織器官中TRIM26 表達譜

對小鼠組織的IHC 染色結果進行評分,染色呈深棕色為強表達,不著色為不表達。 IHC 結果分析顯示,TRIM26 在小鼠細胞的細胞質與細胞核中均有表達(圖3)。 TRIM26 表達于食管鱗狀上皮細胞及附屬腺體(圖3A)、胃上皮細胞(圖3B)、小腸和結腸上皮細胞(圖3C、3D)、胰島細胞及外分泌腺(圖3E)、腦神經元及膠質細胞(圖3F)、細小支氣管上皮細胞及肺泡上皮細胞(圖3G)、腎小管上皮細胞和腎小球細胞(圖3H)以及子宮內膜腺上皮細胞(圖3I)。

2.4 RT-qPCR 揭示TRIM26 在小鼠主要組織器官中的表達水平

RT-qPCR 檢測了TRIM26 在小鼠組織中的表達量,結果如圖4 所示。 選擇在小鼠組織中表達量最低的心臟為1,其它組織器官按其相對表達量作圖。結果顯示,TRIM26 在小鼠的脾、肺和胰腺組織上的表達量相對較高。

圖1 TRIM26 在人體主要組織器官中的表達Note.A, Esophagus.B, Stomach.C, Small Intestine.D, Colon.E, Liver.F, Pancreas.G, Brain.H, Trachea.I, Lung.J, Spleen.K, Kidney.L, Ovary.M, Endometrium.N, Thyroid.O, Breast.P, Skin.Figure 1 Expression of TRIM26 in human tissues and organs

圖2 TRIM26 在人體主要組織器官中的相對表達量Figure 2 The relative expression of TRIM26 in human tissues and organs

3 討論

本研究通過IHC 和RT-qPCR 明確了TRIM26基因在人和小鼠主要組織器官中的表達定位及相對表達量。 研究發現,TRIM26 在細胞核與細胞質中均有表達,且多表達于上皮細胞,其表達定位在人和小鼠的主要組織器官中具有高度的一致性,同時表達于食管鱗狀上皮,胃、小腸和結腸的上皮細胞,胰島細胞,腦神經元和膠質細胞和子宮內膜腺上皮細胞等。

根據文獻報道,TRIM 蛋白參與調控腫瘤的發生發展[5],這與蛋白在組織中的表達與定位密切 相 關。 在 結 直 腸 癌 中,Williams 等[14]發 現TRIM26 通過泛素化調節NTH1 實現人結直腸癌HCT116 細胞對氧化應激敏感性的調控；本研究證實,TRIM26 在人和小鼠的結腸上皮細胞上有表達,可進一步通過基因修飾小鼠探究該基因在結直腸癌進程中的調控方式。 Wang 等[17]發現TRIM26 在肝癌臨床組織標本中的表達水平量明顯下調,且該基因表達缺失與肝細胞癌的惡性程度密切相關；本研究中,TRIM26 表達于肝細胞胞質中,以上結果提示TRIM26 可能發揮抑癌基因的功能,降低該基因在肝細胞上的表達水平,可接下來探討其表達缺失與肝癌發生的相關性。另外,趙學英等[18]和李振強等[19]分別在膠質瘤細胞中過表達和沉默TRIM26 表達,證實TRIM26 正向調控了膠質瘤細胞的增殖,并與患者的預后呈負相關。 本研究發現,TRIM26 在人和小鼠的腦膠質細胞中均有較強的表達,這提示TRIM26 在膠質細胞中表達水平變化可能引起細胞功能的改變。 由此可見,明確TRIM26 的表達定位與表達水平在研究腫瘤的發生發展過程中具有重大意義。 然而,目前對于TRIM26 在人和小鼠主要組織器官中的功能還知之甚少,還有待進一步深入研究。

圖3 TRIM26 在小鼠主要組織器官中的表達Note.A, Esophagus.B, Stomach.C, Small Intestine.D, Colon.E, Pancreas.F, Brain.G, Lung.H, Kidney.I, Endometrium.Figure 3 The expression of TRIM26 in different tissues and organs of mice

圖4 TRIM26 在小鼠主要組織器官中的相對表達量Note.WAT, White adipose tissue.Figure 4 The relative expression of TRIM26 in different tissues and organs of mice

此外,本研究發現TRIM26 在胰島細胞上的表達尤為明顯,IHC 結果顯示,該基因在胰島細胞上的表達強度明顯高于胰腺外分泌腺細胞,在小鼠胰腺上亦得到了類似的結果。 可見,TRIM26 在胰島細胞上可能發揮重要而特殊的功能。 根據此結果,本課題組已委托南京大學-南京生物醫藥研究院構建了TRIM26 條件性基因敲除小鼠,擬再與Pdx-Cre 小鼠交配,獲得胰島 β 細胞特異性敲除TRIM26 的C57BL/6 小鼠,進而探究該基因在胰島細胞上的功能。

本實驗在對成人組織與成年小鼠的研究中發現,TRIM26 表達具有一定的組織器官特異性,提示其功能的復雜性和組織器官依賴的特征。 為深入探究TRIM26 在生長發育過程中承擔的生物學功能,本課題組將利用小鼠進一步明確TRIM26 在胚胎發育至老齡化過程中的不同時期、不同組織器官中RNA 表達水平及蛋白表達量的變化,完善該基因在不同時間與空間的表達譜和功能譜,不僅為后續探索TRIM26 基因在組織發育中的分子調控機制奠定基礎,同時對于利用基因修飾小鼠闡明該基因在研究腫瘤的發生發展過程中的作用也是十分重要的。