P21 抑制劑UC2288 誘導(dǎo)鼻咽癌放射抗拒細(xì)胞CNE-2R凋亡的研究

梁仁拔李欣曉朱小東

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院,南寧 530021；2.廣西區(qū)域高發(fā)腫瘤早期防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南寧 530021；3.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬武鳴醫(yī)院,南寧 530021)

鼻咽癌是發(fā)生于鼻咽部的惡性上皮腫瘤,常見(jiàn)于我國(guó)南方及東南亞地區(qū),尤其在廣東省高發(fā),俗稱“廣東瘤”[1]。 放射治療是鼻咽癌的主要治療手段,大部分早期患者通過(guò)放射治療能得到根治。 遺憾的是,臨床上約有20%的鼻咽癌患者經(jīng)過(guò)治療后仍出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[2-3],主要?dú)w因于鼻咽癌放射抗拒。 再程放療毒副反應(yīng)大,而且以鉑類為基礎(chǔ)的化療反應(yīng)率為40%～65%,預(yù)后差[3]。 因此,有必要探索更多的治療策略,為鼻咽癌的治療提供新的選擇。

P21 是周期蛋白依賴性激酶抑制劑,參與DNA損傷反應(yīng)[4]。 UC2288,分子式為C20H18ClF6N3O2,全稱叫反-1-(4-氯-3-三氟甲基-苯)-3-[4-(5-三氟甲基-吡 啶-2-烷 氧 基)-環(huán) 己 基]-脲。 研 究 發(fā) 現(xiàn),UC2288 是P21 的抑制劑,通過(guò)轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后途徑下調(diào)P21 的表達(dá)[5]。 UC2288 的結(jié)構(gòu)與索拉非尼的結(jié)構(gòu)相似[5]。 作為多種激酶抑制劑,索拉非尼能有效延長(zhǎng)晚期肝癌、腎癌患者生存時(shí)間[6-7],在復(fù)發(fā)或者轉(zhuǎn)移鼻咽癌患者中,也顯示出一定的抗腫瘤作用[8-9]。 然而,與索拉非尼不同的是,UC2288 不抑制RAF 激 酶 或 者 VEGF 活 性[5]。 研 究 發(fā) 現(xiàn),UC2288 對(duì)人結(jié)腸癌HCT116 細(xì)胞有一定的抑制作用[10],但其具體的作用機(jī)制及對(duì)其他腫瘤的影響尚不清楚,有必要進(jìn)行更深入全面的研究。

本研究利用鼻咽癌放射抗拒細(xì)胞株CNE-2R[11-13],探討UC2288 對(duì)CNE-2R 細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其可能的作用機(jī)制,為鼻咽癌的治療提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

CNE-2R 細(xì)胞由廣西醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院放療科構(gòu)建。

1.2 主要試劑與儀器

UC2288 購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司；RPMI-1640 培養(yǎng)基,胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；青鏈霉素,二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自中國(guó)索萊寶公司；0.25%胰蛋白酶-EDTA 消化液購(gòu)自中國(guó)碧云天公司；PBS 緩沖液購(gòu)自中國(guó)中杉金橋公司；CCK-8 試劑盒購(gòu)自日本同仁公司；Annexin V-APC/7-AAD 雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD 公司；Hoechst 33342 染色液中國(guó)索萊寶公司；BCA 蛋白定量試劑盒中國(guó)碧云天公司；Western blot 所用抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology 公司；增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光自顯影試劑盒(enhanced chemiluminescence,ECL)購(gòu)自中國(guó)百智生物公司；EVOS FL Auto 熒光顯微鏡購(gòu)自美國(guó)Life technologies 公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

鼻咽癌放射抗拒細(xì)胞CNE-2R 用RPMI-1640 完全培養(yǎng)液(含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素)置于37℃、5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至融合度達(dá)90%以上時(shí),用胰酶消化傳代。

1.3.2 藥物配制

UC2288 用二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)配成5 mmol/L 的母液,置于-20℃冰箱儲(chǔ)存。 臨用時(shí)用完全培養(yǎng)液配制成不同濃度的工作液。

1.3.3 CCK-8 實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CNE-2R 細(xì)胞,以3500 個(gè)/孔、每孔100 μL 接種于96 孔板中培養(yǎng),設(shè)空白組(不含細(xì)胞的培養(yǎng)液)、對(duì)照組(DMSO 組)及UC2288 處理組(2、4、6、8、12、16 μmol/L),每組5 個(gè)平行孔。24 h后,棄原培養(yǎng)液,按以上分組作用細(xì)胞24、48 h,每孔加入10 μL CCK-8 試劑,37℃避光孵育1 h 后,用酶標(biāo)儀測(cè)450 nm 處吸光度(OD)值,計(jì)算細(xì)胞存活率。 存活率(%)= (OD處理組-OD空白組)/(OD對(duì)照組-OD空白組)×100%。

1.3.4 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)

以300 個(gè)細(xì)胞/孔接種于6 孔板,置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后,用不同濃度的藥物(0、2、4、6、8 μmol/L)作用細(xì)胞48 h。 更換新培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)12 d 后,PBS 緩慢沖洗2 次,4%多聚甲醛固定30 min,姬姆薩染色30 min,晾干后拍照,利用Image J 軟件計(jì)算克隆數(shù)。

1.3.5 觀察細(xì)胞形態(tài)

細(xì)胞接種于6 孔板,培養(yǎng)24 h 后,用不同濃度的藥物(0(DMSO),4、6、8、12、16 μmol/L)作用細(xì)胞48 h。 于倒置顯微鏡觀察細(xì)胞數(shù)量及形態(tài)變化。

1.3.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

堆料裝置行走機(jī)構(gòu)采用自行式驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)，對(duì)于場(chǎng)地不平的堆場(chǎng)建議采用履帶式行走系統(tǒng)，行走機(jī)構(gòu)在駕駛室通過(guò)操縱桿控制，操作自如。

取適量細(xì)胞接種于6 孔板中,待細(xì)胞貼壁后棄去舊培養(yǎng)基,加入不同濃度的藥物(0、4、6、8、12 μmol/L)。 培養(yǎng)48 h 后,收集上清液,用不含EDTA 的胰蛋白酶消化并收集細(xì)胞,根據(jù)Annexin V-APC/7-AAD 試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,1 h 內(nèi)上流式機(jī)檢測(cè)。

1.3.7 Hoechst 33342 染色實(shí)驗(yàn)

取適量細(xì)胞接種于6 孔板中,待細(xì)胞貼壁后棄去舊培養(yǎng)基,加不同濃度的藥物(0、4、8 μmol/L)。作用24 h 后,用PBS 緩慢沖洗2 次,每孔加入1 mL Hoechst 33342 染色液,37℃避光孵育30 min。 棄染色液,用PBS 洗滌2 次,于熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核的形態(tài)及染色的亮度。

1.3.8 蛋白免疫印跡

將細(xì)胞接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中,培養(yǎng)至融合度為70%左右時(shí),加不同濃度的藥物(0、4、8 μmol/L)。 處理24 h 后,提取細(xì)胞蛋白,以BCA 法測(cè)蛋白濃度。 將蛋白樣品等體積上樣于10% SDS-PAGE電泳,冰中恒壓濕轉(zhuǎn)。 5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。TBST 洗膜,一抗Bcl-2(1 ∶1000)、Bax(1 ∶1000)、Survivin(1 ∶1000)、Cleaved-caspase 3(1 ∶1000)、Caspase 3(1 ∶1000)、γ-H2AX(1 ∶1000)、P21(1 ∶1000)、PARP(1 ∶1000)、GAPDH(1 ∶1000)4℃ 孵育過(guò)夜,TBST 洗膜3 次,每次10 min。 HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG 二抗(1 ∶1000)室溫孵育1 h。 TBST 洗膜3 次,每次10 min。 ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行曝光顯影。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 UC2288 降低CNE-2R 細(xì)胞的活力

UC2288 結(jié)構(gòu)如圖1A 所示。 CCK8 結(jié)果顯示,UC2288 明顯抑制CNE-2R 細(xì)胞的增殖,呈劑量依賴和時(shí)間依賴關(guān)系。 與對(duì)照組相比,當(dāng)UC2288 濃度≥4 μmol/L 時(shí),各組間存活率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05,圖1B)

2.2 UC2288 抑制CNE-2R 細(xì)胞克隆形成

為進(jìn)一步驗(yàn)證UC2288 對(duì)細(xì)胞增殖的影響,進(jìn)行克隆形成實(shí)驗(yàn)。 結(jié)果表明,濃度≥4 μmol/L處理組的克隆形成數(shù)目明顯減少(圖2A),與對(duì)照組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05,圖2B)。 這顯示UC2288 對(duì)細(xì)胞的長(zhǎng)期增殖能力也有明顯的抑制作用。

2.3 顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化

UC2288 處理CNE-2R 細(xì)胞48 h 后,直接在顯微鏡下觀察,隨著濃度的增加,細(xì)胞圓形萎縮或結(jié)構(gòu)不完整, 體積變小, 脫落增多。 當(dāng)濃度為16 μmol/L 時(shí),細(xì)胞大部分脫落死亡(圖3A)。Hoechst 染色后通過(guò)熒光顯微鏡觀察,經(jīng)藥物處理后,細(xì)胞核皺縮,染色亮度增高,呈致密濃染或呈碎塊狀致密濃染(圖3B),表明細(xì)胞染色質(zhì)凝聚濃縮,發(fā)生凋亡。

圖1 UC2288 對(duì)CNE-2R 細(xì)胞活力的影響Note.A, Structure of UC2288.B, Cell viability.Compared with control group, **P＜0.01, ***P＜0.001.Figure 1 The effects of UC2288 on cell viability of CNE-2R

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

鑒于UC2288 抑制細(xì)胞的增殖,且形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在藥物的作用下發(fā)生死亡,本研究運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步檢測(cè)UC2288 對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。Annexin V-APC/7-AAD 雙染實(shí)驗(yàn)表明,隨著UC2288濃度的增高,細(xì)胞凋亡率顯著增加(圖4A),各處理組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05,圖4B)。

圖2 UC2288 對(duì)CNE-2R 細(xì)胞克隆形成能力的影響Note.Compared with control group, **P＜0.01, ***P＜0.001.Figure 2 The Effects of UC2288 on clone formation ability of CNE-2R

圖3 UC2288 對(duì)CNE-2R 細(xì)胞形態(tài)的影響Note.A, Cell morphology under light microscope.B, Hoechst 33342 staining.Figure 3 The effects of UC2288 on cell morphology of CNE-2R

2.5 UC2288 對(duì)凋亡相關(guān)蛋白的影響

蛋白免疫印跡結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,隨著UC2288 濃度的提高,促凋亡蛋白Bax、Cleavedcaspase 3、Caspase 3 表達(dá)增高,而抗凋亡蛋白Bcl-2、Survivin 表達(dá)下降。 DNA 雙鏈斷裂標(biāo)志蛋白 γ-H2AX 表達(dá)升高,預(yù)示DNA 發(fā)生斷裂損傷。 結(jié)果表明,UC2288 可能通過(guò)誘導(dǎo)DNA 雙鏈斷裂,引起細(xì)胞凋亡(圖5)。

2.6 UC2288 對(duì)PARP 蛋白的影響

聚腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase,PARP]是DNA 修復(fù)酶。 如圖6 所示,UC2288 作用細(xì)胞后,PARP 表達(dá)水平明顯降低。 這表明,UC2288 可能通過(guò)抑制PARP 表達(dá),誘導(dǎo)DNA損傷。

圖4 UC2288 對(duì)CNE-2R 細(xì)胞凋亡的影響Note.Compared with control group, *P＜0.01, ***P＜0.001.Figure 4 The effects of UC2288 on cell apoptosis of CNE-2R

圖5 UC2288 對(duì)CNE-2R 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Note.Compared with control group, *P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001.Figure 5 The effects of UC2288 on expression of apoptosis-related proteins in CNE-2R

圖6 UC2288 對(duì)CNE-2R 細(xì)胞PARP 蛋白表達(dá)的影響Note.Compared with control group, **P＜0.01, ***P＜0.001.Figure 6 The effects of UC2288 on expression of PARP in CNE-2R

3 討論

鼻咽癌好發(fā)于東南亞地區(qū)。 每年新發(fā)病大約87000 例,70%患者是局部晚期[14]。 局部晚期鼻咽癌的標(biāo)準(zhǔn)治療方案是放化療。 經(jīng)過(guò)治療后,仍有10%患者出現(xiàn)殘留或局部復(fù)發(fā)[15-16]。 再程放療和手術(shù)可挽救局部治療失敗。 然而,再程放療風(fēng)險(xiǎn)大,約33%患者發(fā)生5 級(jí)毒副反應(yīng)[17]。 鼻咽位置較深,結(jié)構(gòu)復(fù)雜,挽救性手術(shù)難度大,且40%以上的患者出現(xiàn)面部麻木、牙關(guān)緊閉、腭瘺等并發(fā)癥[18]。 對(duì)于遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者,采用以順鉑為基礎(chǔ)的姑息化療,反應(yīng)率為40%～65%。 因此,需探索更多的治療策略,為提高鼻咽癌療效提供更多的選擇。

本研究發(fā)現(xiàn),UC2288 明顯抑制CNE-2R 細(xì)胞的增殖,呈濃度-效應(yīng)和時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系；Hoechst 33342 染色實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果提示UC2288 誘導(dǎo)CNE-2R 細(xì)胞凋亡,隨著濃度的增加,凋亡率顯著升高,且Western blot 中促凋亡蛋白Bax、Cleavedcaspase 3、Caspase 3 表達(dá)增高和抗凋亡蛋白Bcl-2、Survivin 表達(dá)下降,更加驗(yàn)證UC2288 的促凋亡作用。

聚腺苷二磷酸核糖聚合酶在DNA 單鏈斷裂(single strand breaks,SSBs)修復(fù)中發(fā)揮重要的作用,主要通過(guò)堿基切除修復(fù)(base excision repair,BER)途徑[19]。 PARP 被激活時(shí),招募其他DNA 修復(fù)蛋白,參與DNA 損傷修復(fù)[20]。 抑制PARP 活性,可阻止DNA 單鏈斷裂的修復(fù),產(chǎn)生雙鏈斷裂,最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[21-22]。 因此,PARP 抑制劑已運(yùn)用于臨床,在卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌和前列腺癌治療中取得良好的療效[23]。 有研究發(fā)現(xiàn),P21 調(diào)節(jié)PARP活性,參與DNA 損傷修復(fù)[24]。 敲除P21,引起PARP 活化,減少DNA 損傷[25]。 本研究中,UC2288作用CNE-2R 細(xì)胞后,γ-H2AX 表達(dá)增加,PARP 表達(dá)下降,而P21 表達(dá)不呈劑量依賴性變化,這提示UC2288 可能不是通過(guò)P21 途徑調(diào)控PARP,UC2288可能通過(guò)直接抑制PARP 的活性,從而引起DNA 雙鏈斷裂。 然而,這需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的探索。

綜上,本研究表明UC2288 可顯著抑制CNE-2R細(xì)胞的增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,這可能與降低PARP 活性,引起DNA 雙鏈斷裂有關(guān)。 這為UC2288 進(jìn)一步的研究提供理論基礎(chǔ),有可能為鼻咽癌的綜合治療提供更多的選擇。