d-δ-生育酚抑制人晶狀體上皮SRA細胞生長及相關機制

秦 程，曾新生，彭 勃，唐玉妮，周友弟，宋 博

0引言

白內障超聲乳化吸除術聯合人工晶狀體植入術已成為治療白內障的主要手段。然而，術后后囊膜混濁(posterior capsule opacification，PCO)仍是影響治療效果的重要因素。術后PCO即后發性白內障是白內障手術后常見的并發癥，是影響治療效果的主要因素。PCO的形成主要是術后殘留的晶狀體上皮細胞過度增殖并移行于后囊膜，轉化為成纖維細胞，產生膠原、分泌基底膜樣物質而引起[1]。

天然維生素E(natural vitamin E)，學名生育酚(tocopherols)，生育酚同系物在自然界中廣泛分布并且主要存在于各種植物中。d-δ-生育酚是其中的一種[2]。研究表明d-δ-生育酚在減少炎癥、細胞增殖和腫瘤負擔方面表現出了更大的能力[3]。我們通過實驗探究d-δ-生育酚對人晶狀體上皮SRA細胞生長的影響以及所涉及的相關分子機制，可能與凋亡相關蛋白bcl-2、bax或者與細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑CyclinD1、P21相關，以便發現其發揮作用的具體靶點，為d-δ-生育酚發揮其藥物學功能，也為治療及預防PCO提供理論支持。

1材料和方法

1.1材料實驗用細胞株:人晶狀體上皮SRA細胞(中國醫學科學院腫瘤醫院腫瘤研究所)、d-δ-生育酚(北京索萊寶科技有限公司)、RIPA裂解液、MTT試劑、二甲基亞砜，碘化丙啶，新生牛血清、1640培養基(Gibco公司)。主要儀器：分選型流式細胞儀(美國BD公司)、超高速冷凍離心機(德國Zeiss公司)、光柵型連續波長酶標儀、研究級倒置熒光顯微鏡、CO2培養箱、倒置相差顯微鏡(日本Olympus)、MLDEL酶標儀(美國Coulter公司)，P21、Cyclin D1、bax及bcl-2抗體均產自英國Abcam公司。

1.2方法通過預實驗，MTT檢測結果及IC50(半抑制率)值，篩選出5個實驗濃度。將此次實驗分為空白對照組(0μmol/L)及實驗組，實驗組設5個不同濃度的d-δ-生育酚(40、60、80、100、120μmol/L)，分別處理人晶狀體上皮SRA細胞24、48、72h，使用20%胎牛血清的DMEM低糖培養液培養人晶狀體上皮SRA細胞，在5.0% CO2飽和度、37℃恒溫培養箱中培養。

1.2.1細胞形態學觀察d-δ-生育酚處理人晶狀體上皮SRA細胞24、48、72h后，顯微鏡下觀察人晶狀體上皮SRA細胞的增殖及細胞形態的變化，拍照記錄結果。

1.2.2 MTT法檢測細胞增殖取生長狀態良好的SRA細胞，胰酶消化、離心、計數，使細胞密度為3.5×106/L，接種到96孔板，每個孔加入200μL，放于37.0℃、5.0% CO2恒溫培養箱中培養，次日更換培養液，按所設藥物濃度分別加入d-δ-生育酚，培養24、48、72h后，每孔加入20μL的MTT培養4h后終止培養，吸凈舊液，每孔加入200μL DMSO(二甲基亞砜)，使用波長為490nm，酶標儀上檢測OD值，以上實驗重復3次，計算d-δ-生育酚對組胞增殖率的影響，細胞增殖抑制率(%)=(1-加藥組OD值/對照組OD值)×100%。

1.2.3流式細胞儀分析細胞周期取對數期生長狀態良好細胞接種于培養瓶中。往培養瓶中加入d-δ-生育酚，使其濃度分別為設定濃度，藥物作用48h后用PBS洗兩遍，用無EDTA的胰酶消化細胞，1000r/min, 5min，離心，加入5mL 75.0%預冷乙醇中，輕輕吹打均勻，-20℃固定保存。1000r/min, 5min，離心，PBS輕輕吹打細胞，洗兩遍。0.5mL PBS重懸細胞，加入PI和RNaseA至終濃度50μg/mL，37.0℃溫浴30min。上機檢測細胞周期。

1.2.4 Western blot法檢測d-δ-生育酚刺激人晶狀體上皮SRA細胞P21、Cyclin D1、bax、bcl-2蛋白表達情況將人晶狀體上皮SRA細胞傳代后分6組。使其濃度分別為設定濃度，提取細胞蛋白，BCA法蛋白濃度定量，配制好15%的分離膠和5%的濃縮膠，每孔加入30μg為蛋白上樣量，上樣前沸水中煮沸5min使蛋白變性。準備電泳，先80V恒壓，30min，等待濃縮膠跟分離膠分離之后，再調整電壓至120V，50min。電泳結束后，恒定電流260mA，50min轉膜，把轉好的膜放入5%的脫脂奶粉封閉液中，搖床上室溫封閉2h，封閉結束后，TBST洗3次，一次10min，放入提前配好的一抗孵育盒中(P21為1∶500；Cyclin D1為1∶500；bax為1∶1000；bcl-2為1∶1000)，4℃慢搖過夜，次日用TBST洗3次，一次10min，放入二抗孵育盒中，室溫下慢搖1h，TBST洗3次，一次10min，發光。發光結束后得到目的條帶，使用Gel-Pro Analyzer軟件分析蛋白的相對表達量。

2結果

2.1倒置相差顯微鏡下觀察d-δ-生育酚對SRA細胞形態的影響體外培養人晶狀體SRA細胞呈多邊形，胞體邊界清楚，貼壁生長，胞質均勻，折光性強，生長速度快。d-δ-生育酚處理細胞48h后，倒置相差顯微鏡下觀察，隨著d-δ-生育酚的濃度逐漸增加，SRA細胞較對照組細胞明顯減少，細胞密度逐漸變低，漂浮的死亡細胞逐漸增多，部分細胞皺縮變圓、貼壁不牢，見圖1。

圖1 倒置相差顯微鏡下觀察48h后d-δ-生育酚對SRA細胞增殖的影響(100×) A：對照組；B：40μmol/L組；C：60μmol/L組；D：80μmol/L組；E：100μmol/L組；F：120μmol/L組。

2.2不同濃度d-δ-生育酚對人晶狀體上皮SRA細胞增殖的影響MTT法結果顯示，d-δ-生育酚分別作用于人晶狀體上皮SRA細胞24、48、72h后，SRA細胞的增殖受到抑制，隨著d-δ-生育酚濃度的逐漸增加，人晶狀體上皮SRA細胞的增殖率也逐漸降低，隨著d-δ-生育酚濃度的增高、作用時間的延長，SRA細胞增殖抑制率逐漸增高，且呈劑量-效應關系，這種關系范圍在(40～120μmol/L)之間最為明顯。分析結果顯示，24、48、72h，六組抑制率差異均有統計學意義(P<0.001)，進一步做兩兩比較,三個時點結果都表現為對照組<40μmol/L組<60μmol/L組<80μmol/L組<100μmol/L組<120μmol/L組，兩組間差異均有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 不同濃度組不同時間抑制率比較

2.3 d-δ-生育酚對人晶狀體上皮SRA細胞周期的影響根據MTT的結果分析，人晶狀體上皮SRA細使用d-δ-生育酚處理48h后，藥物達到最有效抑制細胞增殖效果，故選取d-δ-生育酚處理細胞48h后作為實驗對象。如圖2示細胞被阻滯于S期，六組S期細胞率差異有統計學意義(F=69.447，P<0.001)，兩兩比較結果見表2。

圖2 d-δ-生育酚對人晶狀體上皮SRA細胞周期的影響 A：對照組；B：40μmol/L組；C：60μmol/L組；D：80μmol/L組；E：100μmol/L組；F：120μmol/L組。

表2 不同濃度組S期細胞率比較

2.4 Western blot檢測Cyclin D1、P21、bax和bcl-2的表達d-δ-生育酚干預人晶狀體上皮SRA細胞48h后，人晶狀體上皮SRA細胞P21、Cyclin D1和bcl-2表達量逐漸降低，bax表達量逐漸增高，見圖3。不同濃度組各蛋白表達水平比較，差異均有統計學意義(P<0.001)，各蛋白兩兩組間比較結果,見表3。

圖3 Western blot檢測Cyclin D1、P21、bax和bcl-2的表達。

表3 不同濃度組各蛋白表達水平比較

3討論

正常的人晶狀體上皮細胞為單層立方上皮,主要位于前囊下和赤道部，具有增殖和分化的能力,并且不斷的產生晶狀體纖維[4]。白內障摘除術術后,人晶狀體上皮細胞失去單層性及晶狀體皮質的壓力，加速轉化為成纖維細胞[5]，形成后發性白內障。據報道，多達20%～30%的患者術后會發生后發性白內障[6]，成人在2～5a內后發性白內障的發生率高達50%，兒童術后早期即可發生嚴重的PCO，兒童晶狀體上皮細胞增殖能力強，因而PCO的發生概率高達100%[7]。目前治療后發性白內障主要是激光后囊膜切開術，激光后囊膜切開術會伴有人工晶狀體(intraocular lens，IOL)偏離、眼壓升高、葡萄膜炎、黃斑水腫、甚至視網膜脫離等并發癥[8-9]。除了手術治療后發性白內障之外，目前臨床上對后發性白內障的藥物治療及防治也有了大量的研究。許多藥物已被證實可有效抑制人晶狀體上皮細胞增生，如地塞米松、雙氯芬酸鈉、皂草素、姜黃素等。有研究表明，通過IOL而釋放藥物是藥物作用的最佳途徑，其原理是將抑制細胞增殖的藥物以不同方式修飾于IOL表面或浸潤、裝載于IOL中，這種方式可以使白內障術后的藥物逐漸釋放從而抑制PCO的形成[10]。但是這些藥物在起效的同時對眼內其他結構，包括對角膜內皮細胞、視網膜細胞等產生損害，可引起虹膜色素沉著、暫時性角膜水腫和黃斑水腫等并發癥。這也是這些藥物使用的限制性因素。而d-δ-生育酚在綠色植物中容易獲得且安全，是一種天然藥物，與其他藥物相比有更好的優越性，并發癥少。研究發現d-δ-生育酚在減少炎癥、細胞增殖和腫瘤負擔方面表現出了更大的能力[3]。而人晶狀體上皮細胞的增殖與癌細胞的不斷增殖有共性。因此推測d-δ-生育酚可能通過某些作用機制而抑制人晶狀體上皮細胞的增殖。本研究發現，在顯微鏡下觀察，對照組人晶狀體上皮SRA細胞呈多邊形，胞體邊界清楚，胞質均勻，生長速度快。而實驗組SRA細胞數量明顯減少，細胞密度變低，漂浮的死亡細胞明顯增多。隨著d-δ-生育酚的濃度逐漸增加，細胞的增殖明顯受抑制，具有劑量-效應關系。120μmol/L的d-δ-生育酚作用48h后，抑制率達(70.19±2.26)%。

細胞周期結果顯示：d-δ-生育酚能明顯抑制人晶狀體上皮SRA細胞的增殖，并阻滯細胞周期于S期。Western blot檢測結果分析，d-δ-生育酚抑制人晶狀體上皮SRA細胞的增殖可能是通過抑制bcl-2、P21、Cyclin D1的表達，誘導bax的表達實現的。本研究結果對d-δ-生育酚用于后發性白內障的靶向治療提供一種新的思路。

Western blot檢測結果顯示：與對照組相比，經d-δ-生育酚干預的人晶狀體上皮SRA細胞隨著藥物濃度的增加，P21表達量逐漸降低，與預期的結果相反，分析其原因可能有:(1)有研究表明，P21在不同組織如在腎臟、鼻咽癌細胞株等組織或者惡性腫瘤中表現為表達下降，對其細胞的增殖呈負向調控作用[11-12]，而在心臟、食管鱗狀細胞癌等組織中P21表現為高表達，對其細胞增殖的正向調控作用[13-14]。本研究在人晶狀體上皮SRA細胞研究中獲得低表達的結果提示P21在不同組織中的表達可能具有組織特異性，或者不同的藥物的作用機制可能對P21產生不同的調控作用。這一結果提示在人晶狀體上皮SRA細胞中，調控SRA細胞增殖的可能是CKI家族的其它成員，如Cyclin D1等。(2)P21蛋白為最早發現并克隆的CKI,可與多種CDK競爭結合Cyclin D1,從而抑制細胞的增殖,并且可與PCNA結合，阻斷PCNA依賴的DNA復制，抑制CDK活性，從而使細胞生長受阻于G1期[15]。而細胞周期的結果顯示d-δ-生育酚使細胞的生長阻滯在了S期，說明d-δ-生育酚誘導人晶狀體上皮SRA細胞周期阻滯的途徑與P21無關。(3)P21除了具有促進細胞凋亡的功能外，也具有抗凋亡的雙重功能，本組人晶狀體上皮SRA細胞中P21低表達，是否發揮了抗細胞凋亡的作用，其確切關系有待進一步探討。

總之，本實驗從幾個方面初步探討了d-δ-生育酚對人晶狀體上皮SRA細胞的生長的影響，能夠抑制人晶狀體上皮SRA細胞的增殖。但是本實驗還有許多不足之處，抑制細胞增殖和誘導細胞凋亡的因子很多，這些因子是否發揮了凋亡的作用等，對于確切的機制我們還需要進一步的研究。d-δ-生育酚大量存在于綠色植物中，安全易獲取，值得深入研究。因此，我們將進一步研究d-δ-生育酚在動物模型體內的應用前景，以更好地為臨床PCO的防治提供理論與實驗依據。