miR-221對高糖誘導的人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞凋亡的作用機制

路 璐, 李 歡

0引言

miRNA為短鏈的非編碼內(nèi)源性保守的微小RNA分子，其通過抑制靶基因的轉錄或翻譯過程及調控信號通路的活性，在疾病的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[1]。miR-221在機體多種腫瘤中均出現(xiàn)表達失調，其在糖尿病引起的疾病中也有重要作用[2]，但是其在糖尿病視網(wǎng)膜病變中的功能及作用機制研究甚少。本研究擬以高糖誘導的人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞HRCECs為研究對象，檢測其中miR-221、p53、MDM2的表達，觀察過表達miR-221、抑制miR-221、過表達MDM2對高糖誘導的HRCECs細胞凋亡的影響，揭示miR-221促進高糖誘導的HRCECs細胞凋亡的機制與P53/MDM2信號通路有關。

1材料和方法

1.1材料人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞HRCECs購自ATCC；DMEM培養(yǎng)基購自美國GIBCO公司；Trizol液購自上海恪敏生物科技有限公司；LipofectamineTM2000購自北京宜科思源科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒購自北京艾然生物科技有限公司；逆轉錄試劑盒購自大連TaKaRa公司；RIPA蛋白裂解液購自碧云天生物技術公司；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自北京索萊寶公司。P53抗體購自上海研謹生物科技有限公司；MDM2抗體購自Abcam；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG抗體購自深圳市豪地華拓生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)將人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞HRCECs用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃,5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每2～3d傳代一次。

1.2.2細胞轉染與分組將正常培養(yǎng)的HRCECs細胞分為NG組、HG組、HG+miR-NC組、HG+miR-221組、HG+anti-miR-NC組、HG+anti-miR-221組、HG+miR-221+pcDNA 3.1組、HG+miR-221+pcDNA 3.1-MDM2組。各組細胞的處理方法分別為：NG組：用5mmol/L的葡萄糖處理48h的HRCECs細胞；HG組：用30mmol/L的葡萄糖處理48h的HRCECs細胞；將miR-NC、miR-221 mimics、anti-miR-NC、anti-miR-221、miR-221 mimics+pcDNA 3.1、miR-221 mimics+pcDNA 3.1-MDM2按照脂質體LipofectamineTM2000試劑說明書的操作步驟轉染至HRCECs細胞，轉染5h后，棄去培養(yǎng)液更換新鮮的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48h，用qRT-PCR法確認轉染效率達到要求?！?br>