環孢素A聯合抗真菌藥物體外抗茄病鐮刀菌效果研究

陳曉蓮，楊鎮朵，丁 輝，何 宏，吳嬌嬋，胡獻鋁，鐘興武

0引言

真菌性角膜炎在以農業為主的發展中國家是重要的致盲性眼病，因缺乏有效的治療藥物而增加其嚴重性與危險性。在我國真菌性角膜炎的主要致病菌是鐮刀菌[1-2]，海南省地處熱帶地區，氣候常年潮濕溫熱，真菌性角膜炎的發生率高，主要致病菌以鐮刀菌為主[3-4]。鐮刀菌的體外抗真菌研究顯示其對臨床常用的傳統唑類藥物耐藥[1]，使真菌性角膜潰瘍的治療難度增加。

抗真菌藥物的創新成為真菌性角膜炎治療的關鍵，聯合用藥提高現有抗真菌藥物的治療價值將為真菌性角膜炎的治療帶來曙光。臨床上，器官移植患者在接受免疫抑制劑治療的同時為避免真菌感染常同時聯合使用抗真菌藥物，取得良好治療作用的同時亦觀察到其間存在相互作用[5]。免疫抑制劑環孢素A在眼科已廣泛應用于角膜移植術后抗排斥和干眼癥的治療，而環孢素A聯合抗真菌藥物對真菌性角膜炎分離菌株的藥物敏感性影響鮮見報道。本文對環孢素A與多種抗真菌藥物聯合應用的體外抗真菌效果進行報道。

1對象和方法

1.1對象實驗菌株培養與鑒定：本研究22株茄病鐮刀菌均取自海南省眼科醫院確診真菌性角膜潰瘍患者角膜刮片取材分離菌株。所用菌株均通過檢驗科真菌實驗室的真菌學標準鑒定為茄病鐮刀菌菌種。實驗前所有菌株均在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)斜面35℃培養48～72h，其后在28℃繼續培養至7d。本研究所使用抗真菌藥物為伏立康唑(貨號：Y0001395)，那他霉素(貨號：P9703)，兩性霉素B(貨號：V900919)，氟康唑(貨號：F8929)和環孢素A(貨號：239835)均購自Sigma公司。除氟康唑用蒸餾水溶解外其余所有藥物均以分析純級DMSO溶解成儲存液，濃度為氟康唑5120μg/mL，其余4種藥物均為1600μg/mL。培養基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)、RPMI1640液體培養基。

1.2方法

1.2.1微量肉湯稀釋法評價抗真菌藥物單獨使用藥物敏感性參考CLSI M27-Ed4[6]及M38-Ed3[7]方案在96孔微型滴定板上進行微量肉湯稀釋法。為選擇每種藥物對菌株不同敏感性的合適濃度范圍，對每個菌株進行探索性研究并確定個體藥物的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentrations，MIC)。以RPMI1640液體培養基稀釋藥液使其成為2倍工作濃度，篩選伏立康唑、那他霉素、兩性霉素B、氟康唑和環孢素A的濃度應用范圍，即最終濃度分別是伏立康唑32～0.06μg/mL，兩性霉素B 32～0.06μg/mL，那他霉素128～0.25μg/mL，氟康唑256～0.5μg/mL，環孢素A 256～0.5μg/mL。將各個藥物分別加在96孔板的A～D行每行的1～10列按照濃度從高到低加入稀釋好的藥液各100μL，同時設立生長對照(無藥物孔)和陰性對照(無菌孔)。

菌懸液制作：茄病鐮刀菌于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基35℃培養48～72h，再轉入28℃培養至7d。將菌轉入0.85%鹽水1mL中，滴入吐溫20去除菌絲片段，靜置3～5min取上清液轉移至無菌管，震蕩15s。用光線路徑1cm比色杯測530nm光密度為0.15～0.17，用經三氮嗎啡啉丙磺酸鈉(MOPS)緩沖(pH=7.0)的2%葡萄糖RPMI1640液體培養基進行1∶50稀釋后得到工作菌液，達到最終要求濃度的2倍，致接種終濃度為(0.5～5)×104CFU/mL。加好藥液的96孔板上除陰性對照孔外其余各孔均加入100μL的2倍終濃度菌懸液，分別于35℃孵育48h。觀察判讀結果，根據中華人民共和國衛生行業標準(WS/T411-2013)《抗絲狀真菌藥物敏感性試驗肉湯稀釋法》中對于MIC結果判讀的標準方法要求，對鐮刀菌的最低抑菌濃度(MIC)終點判斷標準為：觀察到的與生長對照相比除氟康唑是50%抑制其余藥物100%抑制的最低藥物濃度為各藥物的MIC[8]。所有藥敏試驗均重復操作2遍。藥敏質控菌株為ATCC22019。

1.2.2棋盤法評價體外聯合藥物敏感性采用棋盤法測試環孢素A與抗真菌藥物體外聯合藥物敏感性。在96孔板中分別加入環孢素A與不同濃度的1種抗真菌藥物。自左向右1～10列為聯合用藥區，每孔加入4倍終濃度的藥物倍比稀釋液各50μL；每板第1～10列分別為伏立康唑、那他霉素、兩性霉素B和氟康唑，藥物終濃度為伏立康唑16～0.03μg/mL，兩性霉素B 16～0.03μg/mL，那他霉素64～0.125μg/mL，氟康唑128～0.25μg/mL；第8～1行的1～10列分別加入環孢素A至終濃度為128～1μg/L，每行濃度一致，同時設立生長對照和空白對照。接種時除陰性對照孔外其余各孔均加入100μL的2倍終濃度菌懸液。于35℃靜置培養48h判定MIC結果。采用LA理論，將藥物單獨使用或兩種藥物聯合應用時，產生相同藥效的濃度(等效位點)進行比較。部分抑菌濃度指數法分數抑菌濃度指數(fractional inhibitory concentration index，FICI)：FICI=CA/MICA+CB/MICB，其中 MICA為A藥單用時的MIC，MICB為B藥單用時的MIC，CA為兩藥聯用后得到同一抗菌結果時A藥的MIC，CB為兩藥聯用后得到同一抗菌結果時B藥的MIC。FICI值大于4表示兩藥有拮抗作用，FICI值介于0.5和4之間表示兩藥相互作用為無關，FICI≤0.5則表示兩藥有協同作用[9]。

統計學分析：利用SPSS 22.0軟件進行統計分析，計數資料用例數和率[n(%)]表示，兩組差異比較采用卡方檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1菌株鑒定結果本研究培養所得22株鐮刀菌屬菌種鏡下可見透明分隔菌絲、分生孢子梗、瓶梗和大小分生孢子，大分生孢子粗壯、壁厚、光滑，呈鐮刀形至紡錘形，遠端尖，有多個分隔，以3隔居多。小型分生孢子假頭狀著生、光滑、透明，橢圓形、卵圓形、長橢圓形、短臘腸形、逗點形等，通常0～1個隔。茄病鐮刀菌顯微鏡下形態特征，見圖1、2。

圖1 茄病鐮刀菌顯微鏡下形態特征，乳酸酚棉藍染色(大、小分生孢子、菌絲，×100)。

圖2 茄病鐮刀菌顯微鏡下形態特征，乳酸酚棉藍染色(大、小分生孢子，×400)。

2.2單獨及聯合用藥藥敏結果四種抗真菌藥物那他霉素、伏立康唑、兩性霉素B和氟康唑對鐮刀菌(22株)的MIC值范圍分別是2～8、1～8、1～8和8～512μg/mL。那他霉素、伏立康唑與環孢素A體外聯合用藥時，均對所有菌株均無協同效應，無拮抗效應(表1、2)。兩性霉素B與環孢素A聯合應用時，對41%菌株(9/22)有協同效應，對所有菌株無拮抗效應(表3)。氟康唑與環孢素A聯合用藥時，對64%菌株(14/22)有協同效應，無拮抗效應(表4)。

表1 那他霉素單獨及聯合環孢素A對鐮刀菌體外抗真菌藥物敏感性

表2 伏立康唑單獨及聯合環孢素A對鐮刀菌體外抗真菌藥物敏感性

表3 兩性霉素單獨和聯合環孢素A對鐮刀菌體外抗真菌藥物敏感性

表4 氟康唑單獨和聯合環孢素A對鐮刀菌體外抗真菌藥物敏感性

單用抗真菌藥物時對菌株的藥物敏感率分別是那他霉素100%、伏立康唑31.8%、兩性霉素B 4.5%及氟康唑4.5%，聯合使用環孢素A后兩性霉素B的藥物敏感率提升至68.2%。如表5結果顯示，單獨使用及聯合使用環孢素A時，氟康唑、伏立康唑、那他霉素敏感率差異無統計學意義(P>0.05)。聯合使用環孢素A后鐮刀菌對兩性霉素B敏感率高于單獨使用，差異有統計學意義(P<0.001),見圖3。

表5 抗真菌藥物單獨使用及聯合環孢素A對鐮刀菌藥物敏感性比較

圖3 抗真菌藥物單獨使用及聯合環孢素A對鐮刀菌藥物敏感性比較 aP<0.05 vs 單獨使用抗真菌藥物。

3討論

從我院臨床分離鐮刀菌株體外培養抗真菌藥物敏感性研究顯示，通過微量肉湯稀釋法觀察到鐮刀菌對那他霉素的敏感性最高，伏立康唑次之，氟康唑及兩性霉素B均表現為低敏感性，與王志昕等[10]、張陽等[11-12]對眼部真菌感染及藥物敏感性分析結果一致。抗真菌藥物包括唑類及多烯類，唑類包括咪唑類及三唑類，前者以咪康唑為代表，后者包括氟康唑、伏立康唑及伊曲康唑等；多烯類抗真菌藥物主要包括那他霉素及兩性霉素B。有研究表明絲狀真菌感染所致的真菌性角膜炎對酮康唑、咪康唑、伊曲康唑及氟康唑的治療不敏感[13]，且鐮刀菌通常對傳統唑類藥物耐藥，因此在提高藥物敏感性的聯合用藥研究中免疫抑制劑的聯合應用成為關注的熱點。Onyewu等[14]在白念珠菌感染的角膜炎小鼠模型中，聯合使用氟康唑和環孢素A的眼用制劑，顯示出了類似體內藥物的協同作用，能有效地控制白念珠菌感染情況。

環孢素A是一種強效免疫抑制劑，由絲狀真菌茄病鐮刀菌和柱孢霉菌等霉菌的代謝產物中提取分離而得的，是一種含有11個氨基酸的環狀多肽，能夠通過抑制鈣調磷酸酶調控細胞信號傳導通路從而抑制T細胞增殖。在眼科已廣泛應用于干眼癥及角膜移植術后的治療，尤其是在真菌性角膜潰瘍角膜移植術后作為替代糖皮質激素的局部藥物治療[15]。在抗真菌作用機制中，由于鈣調磷酸酶對維持微生物的應激存活具有重要作用，因此環孢素A作為鈣調磷酸酶抑制劑，正逐漸被探索應用于真菌感染的聯合用藥治療，達到抑制真菌的生長目的[16-17]。Bell等[18]在環孢素A的體外抑菌實驗中發現，對尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)、茄病鐮刀菌(Fusarium solani)的菌落數量和煙曲霉菌(Aspergillus fumigatus)菌落大小的抑制呈明顯的劑量依賴性，表明環孢素A具有對真菌的抑制作用。 Shinde等[19]將氟康唑、伏立康唑、卡泊芬凈、兩性霉素、制霉菌素等五種抗真菌藥物與環孢素A的聯合作用，對白念珠菌進行了體外試驗，結果不同抗真菌藥物與環孢素A聯合后對白念珠菌的MIC均降低2～16倍，提示環孢素A能有效提高抗真菌藥對白念珠菌的敏感性。除白念珠菌外，環孢素A與抗真菌藥物聯合應用對曲霉菌、新生隱球菌也可產生協同作用[20]。Mo等[21]研究證實環孢素A與氟康唑聯合使用對馬爾尼菲青霉菌的抗真菌作用具有協同效應。針對與以往研究中菌株的來源不同及聯合用藥的差異比較，本研究結果中也顯示，對臨床標本分離鐮刀菌環孢素A與氟康唑聯合應用對64%菌株有協同效應，與兩性霉素B聯合應用對41%菌株有協同效應，且所有菌株無拮抗效應產生，證實在鐮刀菌屬環孢素A與抗真菌藥物的協同作用。

值得關注的是，協同效應的產生與藥物敏感性的提升可能并不是同步的。本研究中單獨使用抗真菌藥物時菌株對氟康唑和兩性霉素B的藥物敏感率僅為4.5%，伏立康唑的藥物敏感率為31.8%，那他霉素的敏感性最高為100%敏感，表明本研究所用菌株即使對同類型的不用藥物敏感性也存在很大差異。聯合使用環孢素A后，兩性霉素B聯合用藥對41%的菌株產生協同效應并且藥物敏感性大幅提升；而伏立康唑、那他霉素與環孢素A的聯合用藥并未產生協同效應，藥物敏感性也未產生變化；值得注意的是氟康唑在與環孢素A聯合使用后對64%的菌株產生了協同效應，然而藥物敏感性卻并未發生改變，仍表現出很高的耐藥率，即環孢素A的協同效應主要發生在單獨用藥時敏感率低的抗菌藥物及氟康唑和兩性霉素B，但是環孢素A可能一定程度的提高了氟康唑對菌株的抑菌作用但并不能顯著提高其對藥物的敏感性，從而降低了氟康唑聯合用藥的有效性。對于協同效應與藥物敏感性改變的不同步性進行分析，可能的原因如下：首先，菌株的耐藥性不同可能與種屬差異相關。鐮刀菌屬有多種基因型，根據傳統的形態學鑒定將其分為16個組、65個種、55個變種和22個型，不同基因型的鐮刀菌對于抗真菌藥物的敏感性不同[22]。Rosa等[23]將患有惡性白血病并發鐮刀菌感染的菌株進行分離并進行了抗真菌藥敏感性研究，結果發現在這種情況下存在著抗真菌藥物敏感性的物種及菌株特異性差異。其中以茄病鐮刀菌復合體(Fusarium solani species complex，FSSC)更為常見，其次為尖孢鐮刀菌復合體(Fusarium oxysporum species complex，FOSC)，然而臨床分離的茄病鐮刀菌復合體(FSSC)相較于尖孢鐮刀菌復合體(FOSC)對兩性霉素B和伏立康唑的耐藥性明顯增加。本研究中所用菌株為臨床病例標本分離菌株，未對其進行明確的基因分型，因此在藥物敏感性分析中可能存在針對不同基因型的藥物敏感性差異表現。針對此結果可在進一步的研究中分析基因型特異性的藥物敏感性差異表現。此外，菌株的耐藥性差異可能也同時導致了同類型不同藥物、不同類型藥物間存在著協同效應與藥物敏感性的差異。Li等[24]對環孢素A聯合三種唑類抗真菌藥氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑對唑類敏感白念珠菌及唑類耐藥白念珠菌的藥物敏感性作用進行了研究，結果表明環孢素A與唑類藥物聯合使用可表現出協同效應，尤其是對唑類耐藥的白念珠菌菌株協同效應更顯著。同時，就唑類藥物的自身屬性而言，藥物活性與多烯類藥物存在明顯差異。相較于在高濃度時具有殺菌屬性的咪唑類(imidazoles)抗真菌藥物，同屬于三唑類(triazoles)的氟康唑及伏立康唑在抗真菌作用上則更多的表現為抑菌屬性[25]。唑類抗真菌藥物對14-α-去甲基化酶親和力的區別決定了在此類藥物中不同藥物間不同的抗真菌能力和活性譜[26]。伏立康唑作為第二代合成三唑類抗真菌藥物，與傳統的唑類藥物相比抗菌譜廣、活性強，但研究顯示藥物活性仍為抑菌屬性為主。而抑菌屬性的發揮可能較殺菌性能在臨床治療效應中存在一定的限制，本研究結果顯示單獨使用抗真菌藥物時伏立康唑相較于氟康唑表現出明顯高的藥物敏感性，然而均不能產生有效的治療價值，對臨床效益價值的評估有重要意義。

綜上所述，對鐮刀菌感染所致的真菌性角膜炎首選那他霉素治療。環孢素A聯合應用抗真菌藥物時，可與氟康唑和兩性霉素B對鐮刀菌產生協同作用，并且顯著提升兩性霉素B的藥物敏感性，具有重要的臨床意義。本研究進一步豐富了環孢素A在抗真菌治療中的研究結果，能更好的為臨床治療提供參考，但因藥物作用的效果受諸多因素影響，體外實驗不能完全模擬體內環境，加上臨床個體之間的差異，關于環孢素A的聯合用藥實際應用療效分析以及機制研究還需進一步研究并通過在體動物實驗等獲得更好的治療方法。