高正加速度對種植體周圍牙槽骨組織成骨細胞功能的影響

種植義齒修復缺失牙可以達到傳統修復無法比擬的良好功能和美學效果，以及較高的遠期成功率，因此已被口腔醫學界公認為缺失牙修復的首選方式，但是目前在我國，種植牙技術仍未被用于軍事飛行人員的牙列缺損修復[1-2]。軍事飛行人員及航天員在飛行過程中會遇到超重、失重等各種特殊的力學環境，其中以受到高正加速度（+Gz）的作用最多[3]。高正加速度環境會引起人體的一系列生物學效應，包括體質量增加、血液柱流體靜壓增大及血液轉移、器官移位及變形等[4-5]。在種植體骨結合的過程中，成骨細胞是最重要的功能細胞，多種細胞因子都能夠刺激成骨細胞的增殖和活性，促進種植體周圍骨的生長。骨形成蛋白2（bone morphogenetic protein 2，BMP-2）可以誘導間充質細胞向軟骨及成骨樣細胞方向轉化[6-7]；骨橋蛋白（osteopontin，OPN）被認為是成骨細胞在基質形成和成熟階段的特征性標志物[8-9]；而轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）可調節成骨細胞活性[10]。這3個細胞因子都是能夠體現成骨細胞活性與功能的重要標志物。本研究旨在建立動物模型，通過比較BMP-2，OPN和TGF-β1 mRNA在種植體植入后的變化，分析高正加速度環境對于種植術后種植體周圍骨組織中成骨細胞的功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 新西蘭白兔30只，雄性，體質量（2 485±248）g，口內狀況良好，購自北京聯合利華實驗動物養殖中心。

1.1.2 實驗試劑 Trizol（Sigma公司，美國）；SuperRT cDNA第一鏈合成試劑盒（康為世紀公司，北京）；熒光定量PCR檢測試劑盒（ABI公司，美國）。

1.1.3 主要實驗設備 純鈦種植體（山東煙臺威高醫療器械公司，中國）：直徑3 mm，長度10 mm，種植體表面經過大顆粒酸蝕噴砂處理，γ射線消毒后單獨包裝備用。手術器械：牙科探針、拔牙鉗、微創挺、止血鉗、持針器、可吸收縫線、眼科剪、種植體持釘器。術前手術器械常規高溫高壓消毒滅菌。其他實驗設備：小動物離心機（奧普光電技術公司，長春）；Nanodrop-2000分光光度計（Thermo公司，美國）；Roche lightcyler 480 PCR儀（Roche公司，瑞士）；Veriti 96孔梯度PCR儀（ABI公司，美國）。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型的建立與取材 按隨機數字表將30只實驗動物隨機分為3周對照組（A1）、3周實驗組（B1）、5周對照組（A2）、5周實驗組（B2）、12周對照組（A3）、12周實驗組（B3），每組各5只。實驗動物在適應性飼養1周后，在3%戊巴比妥鈉腹腔麻醉和1%阿替卡因腎上腺素注射液局部麻醉下，拔除兔子下頜2顆切牙，在每個拔牙窩內即刻種植1顆種植體，植入扭力矩為15 N·cm，術后嚴密縫合下頜牙齦。術后給動物肌注青霉素40萬 U/d，并每天清理口腔，連續3 d，期間密切觀察其傷口愈合情況及精神活動狀況。術后休息1周，然后實驗組動物在小動物離心機上開始加載+Gz。根據飛行員飛行訓練以及實戰演練的實際情況，并參考國軍標GJB4423-2002高性能殲擊機飛行員離心機訓練方法與評定及國外的訓練方案[11]，設定了實驗動物每次的高正加速度暴露方案，加速度的增長率為1 G/s，加載間隔為1 min，每周暴露3次（周一、周三、周五）（圖1）。對照組動物不進行+Gz暴露，常規飼養。A1、B1組在暴露+Gz2周后處死，A2、B2組在暴露+Gz4周后處死，A3、B3組在A3組暴露+Gz4周，然后常規飼養7周后處死。截取含種植體的標本，修整以后以生理鹽水反復沖洗，用直徑5 mm的環鉆將種植體及其周圍骨質取出，然后剝離種植體周圍的骨質放入液氮中保存備用。每組最后收獲10個標本。

圖1 實驗組動物離心訓練方案

1.2.2 RT-PCR檢測 將骨組織標本放入預冷的研缽中，迅速研磨至細粉，按照Trizol試劑盒的操作步驟提取總RNA，經紫外分光光度計檢測，A260/A280比值在1.8～2.0之間。取2 μg總RNA按照試劑盒的步驟要求合成cDNA并進行RT-PCR檢測，每個cDNA模板都重復加3個孔，并設置以RNase-Free Water替代cDNA模板的陰性對照孔。檢測的目的基因BMP-2、OPN、TGF-β1以及內參基因GAPDH的引物序列參照表1，將最后檢測到的各標本的Ct值采用2-ΔΔCt法計算各樣品的相對表達量。

表1 檢測基因的PCR引物序列

表2 新西蘭白兔平均體質量（g）

1.3 統計學處理 應用SPSS 19.0軟件對數據進行統計分析，若滿足方差齊性，則采用2組獨立樣本的t檢驗進行分析，若不齊，則采用秩和檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 動物的一般情況 30只實驗動物均順利完成了拔牙和即刻種植手術，術后均無死亡，術后第2天動物可自主少量進食。術后術區傷口愈合良好，無紅腫流膿等癥狀。實驗組動物能夠耐受實驗中設計的+Gz環境，在加載+Gz后無明顯異常。整個實驗過程中實驗組動物與對照組動物體質量均穩定增長，2組動物體質量差異無統計學意義（表2）。

2.2 BMP-2，OPN和TGF-β1的mRNA表達情況 實驗組和對照組BMP-2，OPN和TGF-β1的mRNA表達均在術后3周時最高，在術后5周和12周時逐漸降低。術后3周，實驗組BMP-2、OPN和TGF-β1的mRNA表達低于對照組（P＜0.05），分別為對照組的0.55、0.60和0.80倍。術后5周，實驗組TGF-β1的mRNA表達仍低于對照組（P＜0.05），為對照組的0.77倍。術后12周，2組BMP-2，OPN和TGF-β1的mRNA表達差異無統計學意義（表3）。

表3 各組種植體周圍骨組織中BMP-2、OPN和TGF-β1 mRNA的相對表達量

3 討論

種植體-骨結合是一個骨形成和骨改建相結合的過程，在這個過程中，成骨細胞是最重要的功能細胞。多種細胞因子能夠刺激成骨細胞的增殖和活性，促進種植體周圍骨的生長，才能在種植體周圍形成穩固的骨結合[12-13]。

骨形成蛋白是骨形成發生最早期的信號分子，也是目前唯一已經確定具有單獨誘導間充質細胞向軟骨及成骨樣細胞方向轉化，并能異位成骨的生長因子。BMP-2在骨誘導、骨改建及維持骨的礦物質含量中發揮著重要作用[6-7，14]。許多實驗也都證實在種植體周圍局部應用人工合成BMP能夠促進種植體周圍骨形成以及種植體周圍骨缺損的修復[15-16]。OPN是一種基質調節蛋白，在骨基質的吸收、礦化及維持骨組織與周圍組織的完整性中有著重要作用，與骨改建過程有密切關系，被認為是成骨細胞在基質形成和成熟階段的特征性標志物[8-9]。TGF-β1可調節成骨細胞活性，促進骨基質形成，抑制骨基質降解等，對骨組織的形成和改建有重要意義[10，17]。

本研究中術后3周時BMP-2，OPN和TGF-β1的mRNA表達在檢測的3個時間段中都是最高值，以后BMP-2，OPN和TGF-β1的mRNA表達則逐漸降低，說明術后3周時種植體周圍成骨細胞的成骨活性最強，骨形成活動最活躍。術后5周較3周比較，成骨細胞活性略有降低；術后12周時，種植體周圍的骨形成已基本完成，成骨細胞功能減弱、退化。Zhang等[18]的研究發現在種植體植入后第8天OPN mRNA的表達達到高峰，曾玉等[19]的研究也發現OPN蛋白的表達在種植術后2周時增加到高峰，1個月時表達逐漸下降，與本研究結果一致。

高正加速度環境在術后3周時能夠明顯的降低BMP-2，OPN和TGF-β1的mRNA表達，在術后5周時仍能夠明顯降低TGF-β1的mRNA表達，說明高正加速度能夠抑制成骨細胞的分化及成骨作用，減緩骨形成的速度，因此可能會對種植體植入后的骨結合有不利影響。

綜上所述，BMP-2，OPN和TGF-β1在種植體周圍骨組織中的表達變化與種植體周圍骨形成過程一致；高正加速度環境能夠降低BMP-2、OPN和TGF-β1的表達，抑制成骨細胞的功能，減緩骨形成，不利于種植體的愈合。