川芎嗪通過激活PKCα/Nrf2信號轉導抑制七氟烷誘導的氧化損傷和血腦屏障破壞研究*

鄭思敏,張少博,牛曉麗,劉鴻濤,熊虹飛,張會娟

西安交通大學第二附屬醫院麻醉科(西安 710004)

每年有數百萬名產婦和新生兒在分娩或外科手術中接受麻醉，而七氟烷(Sevoflurane)由于其安全性，起效快，恢復快等優點而成為最常見的吸入麻醉藥之一[1-2]，但是七氟烷會損害海馬，并通過神經元凋亡，神經炎癥和線粒體功能障礙等誘發海馬依賴性學習和記憶障礙[3-4]。核轉錄因子Nrf2在調節抗氧化因子產生，維持細胞氧化還原穩態方面起著重要作用，通過抑制蛋白激酶Cα(PKCα)/Nrf2信號通路可以降低Nrf2表達發揮神經保護作用[5]，并可抑制電磁脈沖誘導的ZO-1(小帶閉合蛋白1)易位，從而保護血腦屏障(Blood brain barrier，BBB)生理結構[6]。

川芎嗪(Ligustrazine)是一種傳統中藥，是中藥川芎的主要有效成分，可通過刺激抗氧化酶表達來抑制氧化應激，研究指出，川芎嗪可以通過增加Nrf2的表達增強抗氧化酶基因，例如血紅素加氧酶-1(HO-1)的表達，進而降低氧化應激，治療小鼠神經炎癥[7-8]。然而，川芎嗪對于七氟烷誘導的氧化應激以及BBB通透性異常增加的影響，尚未見詳細報道。

材料與方法

1 動 物 30只懷孕的Wistar雌性大鼠購自西安交通大學醫學院實驗動物中心，飼養于45%～55%濕度，22±1 ℃溫度的動物實驗中心動物房中，在12 h的明暗循環中，自由飲食飲水，實驗共使用100只新生幼鼠，體重16～28 g，1周齡。該研究得到西安交通大學動物保護和使用委員會的批準。

2 麻醉處理 將48只幼鼠(n=12/組)隨機分為四組：對照組，大鼠吸入30%O23 h；七氟烷組，大鼠暴露于1.5%七氟烷和30%O2的環境中作用3 h；七氟烷加川芎嗪組(川芎嗪組)，在吸入七氟烷之前15 min，對幼鼠腹膜內給予川芎嗪(10 mg/kg，溶解在1%的乙醇溶液中)；七氟烷加溶劑組(溶劑組)，在吸入七氟烷之前，用等體積的1%乙醇處理大鼠。

3 組織樣本制備 吸入七氟烷后，在0.5、1、3 h以及6 h時分別頸椎脫臼法處死每組中的6只小鼠，在無菌環境下分離大腦；吸入七氟烷后3 h，頸椎脫臼法處死每組剩余6只小鼠，在無菌環境下分離海馬，將海馬和大腦并固定在10%福爾馬林中，以進行蘇木精和曙紅(HE)，免疫組織化學(IHC)和免疫熒光(IF)。每組幼鼠三個海馬分別使用0.5%的預冷的戊二醛，4%的預冷的低聚甲醛和0.1 mmol/L磷酸鹽緩沖液洗滌，然后將海馬組織浸入含2.5 %戊二醛的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液中，以進行透射電子顯微鏡檢查。將每組幼鼠的六個海馬存放于-80℃冰箱，其余部分海馬用于測量ROS，超氧化物歧化酶，丙二醛和谷胱甘肽。

4 ROS，SOD，MDA，GSH和S100β的測量 收獲海馬和大腦后，通過使用組織均質器(碧云天試劑公司，中國)在裂解緩沖液中均質化，1000 r離心10 min，收集上清液，按照試劑商說明，使用ELISA試劑盒測量ROS，SOD，MDA，GSH和S100β濃度，所用試劑盒均購自百奧萊博公司(中國)。

5 組織病理學觀察 固定海馬體后，以分級乙醇系列進行樣品脫水，然后將樣品包埋在石蠟中，用切片機將石蠟包埋的海馬組織切成5 μm切片，然后用HE染色，在顯微鏡(奧林巴斯，日本)上觀察切片，并進行圖像捕獲。準備用于透射電子顯微鏡檢查的海馬切片以梯度乙醇脫水，將超薄切片(40～60 nm)固定在200目金屬網格上，并用乙酸鈾酰和檸檬酸鉛染色，使用H-7650電子顯微鏡(CST，美國)觀察切片。

6 蛋白質印跡分析 SDS-PAGE分離樣品(30 μg蛋白)并轉移至PVDF膜上，與抗Nrf2一抗 (1∶500，CST，美國)，抗PKCα(1∶1000，CST，美國)，抗HO-1(1∶2000，Beyotime Biotechnology，中國)，抗PCNA(1∶500，Beyotime Biotechnology，中國)和抗β-肌動蛋白(1∶500，Beyotime Biotechnology，中國)，抗ZO-1(1∶1000，CST，美國)，室溫孵育過夜后，與辣根過氧化物酶(HRP)偶聯的山羊抗兔IgG抗體(1∶6000，ZSGB-BIO，美國)室溫孵育2 h。使用ECL Western Blot檢測系統(Thermo Scientific，美國)將蛋白質條帶可視化。以β-肌動蛋白為內參進行蛋白表達標準化，蛋白質印跡實驗重復3次。

7 免疫組織化學染色和免疫熒光 IHC：處理大腦切片和海馬切片以暴露表面抗原，然后與MMP-2(1∶100，CST，美國)，MMP-9(1∶100，CST，美國)，TIMP-1(1∶100，CST，美國)，TIMP-2(1∶100，CST，美國)，HO-1一抗(1∶100，Eyotime Biotechnology，中國)特異性一抗中室溫下孵育2 h，將切片依次與生物素化的連接二抗和過氧化物酶標記的鏈霉親和素各孵育1 h，洗滌后與發色二氨基聯苯胺-四鹽酸鹽(DAB)底物一起孵育，然后在蘇木精中復染，使用奧林巴斯顯微鏡檢查染色的切片。

IF：暴露切片表面抗原后，在室溫下與山羊血清一起孵育4 h，與Nrf2一抗(1∶100，CST，美國)在封閉溶液中于4 ℃孵育過夜，預冷的PBS洗滌3次，與CY3標記的抗兔IgG (1∶300，Goodbio Technology，中國)，然后使用Nikon Eclipse Ni倒置顯微鏡(Nikon，日本)采集圖像。

8 原位酶譜 將腦冷凍切片快速干燥，并用含1%(w/v)瓊脂糖，0.1 mg/ml熒光素偶聯DQ明膠(R&D，美國)的PBS溶液覆蓋，覆蓋2 h后將切片在黑暗中于反應溶液(0.05 mol/L Tris-HCl，0.15 mol/L NaCl，5 mmol/L CaCl2，0.2 mmol/L NaN3)中室溫孵育24 h，使用熒光顯微鏡2000(Nikon TE，日本)記錄圖像。

9 逆轉錄PCR 根據制造商的說明，使用Trizol試劑(海派醫藥，中國)從大鼠大腦皮層中分離總RNA，通過分光光度法評估RNA的純度，通過RT-PCR和特異性引物檢查TJ蛋白ZO-1的RNA表達，肌動蛋白用作上樣對照。在42 ℃下進行逆轉錄60 min，然后加熱至95 ℃5 min。使用如下的特異性引物進一步擴增反轉錄反應的等分試樣：ZO-1正向引物5’-TGTGAGTCCTTCAGCTGTGGA-3’，ZO-1反向引物5’-GGAACTCAACACACCACCATT-3’。肌動蛋白正向引物5’-CAAGGCCAACCGTGAGAA-3’，肌動蛋白反向引物5’-AGGCATACAGGGACAGCACA-3’，將PCR加熱至94 ℃持續5 min，30次循環，分別于94 ℃持續45 s，60 ℃持續45 s，72 ℃持續1 min。

10 統計學方法 使用SPSS 18.0統計學軟件分析數據，數據以均值±標準差表示。通過單向方差分析(ANOVA)分析數據，P<0.05表示差異具有統計學意義，使用GraphPad Prism 7(GraphPad，美國軟件)進行圖形繪制。

結 果

1 川芎嗪減少七氟烷引起的病理損傷 HE染色結果表明，對照組的結構完整，神經元細胞排列緊密，細胞表觀分級，神經元細胞表現出廣泛的細胞質，而細胞核表現為藍色和圓形，核膜完整，核仁清晰；與對照組相比，七氟烷組神經元細胞明顯減少，大多數神經元細胞胞質明顯縮小，細胞間空隙明顯增加，部分神經元細胞核仁消失，細胞的形態發生變化；與七氟烷組相比，川芎嗪組的細胞損傷明顯減輕，海馬神經元呈規則排列，僅觀察到少數細胞核表現為融合性，細胞間間隙明顯降低；在溶劑組中，細胞損傷與七氟烷組相似(圖1)。

注：黑色箭頭表示壞死的神經元；白色箭頭指示增加的細胞間隙

透射電鏡檢查的結果顯示，對照組的神經元細胞核膜清晰可見，形態正常，細胞器豐富，線粒體密集，線粒體膜完整且完整；七氟烷組和溶劑組中，核膜完整性被破壞并且觀察到細胞質空泡化。此外，線粒體結構破壞，部分線粒體雙層膜結構被破壞，高爾基體腔擴大；與對照組相比，在川芎嗪組神經元細胞沒有表現出明顯的變化，核膜完好，線粒體形態正常，只有單個線粒體出現斷裂(圖2)。

注：黑色箭頭表示線粒體破裂；白色箭頭表示核膜不完整

2 七氟烷增加小鼠MMP-2，MMP-9的表達 見表1(圖3)。與對照組相比，七氟烷暴露后的MMP-2蛋白和MMP-9蛋白水平均有明顯地增加，微血管內皮細胞中MMP-2和MMP-9的免疫染色出現明顯增加；此外，對照組和七氟烷組的微血管內皮細胞均未檢測到TIMP-2的免疫染色，TIMP-1的免疫染色也無明顯差異。

A：七氟烷暴露后3 h后微血管內皮細胞中MMP-2的免疫染色增加；B：在對照組和七氟烷組的微血管內皮細胞中未檢測到TIMP-2的免疫染色；C：七氟烷暴露3 h后，微血管內皮細胞中MMP-9的免疫染色增加；D：在對照組和七氟烷組之間，微血管內皮細胞中TIMP-1的免疫染色無明顯變化

表1 兩組小鼠大腦皮層中MMP-2，MMP-9蛋白質相對表達水平

3 川芎嗪抑制七氟烷誘導的明膠分解活性并抑制BBB通透性的增加 見表2(圖4)。與對照組相比，暴露于七氟烷3 h后，腦微血管中的明膠分解活性顯著增加，ZO-1表達顯著下調，而S100β水平明顯升高；與七氟烷組或溶劑組小鼠相比，川芎嗪處理后，明膠分解活性的增加被明顯抑制，ZO-1表達被明顯上調，七氟烷誘導的S100β外滲則顯著減弱。

圖4 川芎嗪抑制七氟烷誘導的明膠分解活性的增加(比例尺=20 μm)

表2 各組小鼠的ZO-1和S100β的相對水平

4 川芎嗪減輕七氟烷誘導的氧化應激 見表3。與對照組相比，七氟烷組和溶劑組小鼠ROS水平顯著增加，BMD水平顯著升高，SOD和GSH的活性顯著降低；與七氟烷組或溶劑組小鼠相比，川芎嗪組小鼠的ROS和BMD水平明顯降低，SOD和GSH的活性顯著升高。

表3 各組小鼠氧化應激相關蛋白的相對表達水平

5 川芎嗪激活 PKCα/Nrf2 通路以減少七氟烷引起的海馬損傷 見表4(圖5)。與對照組相比，七氟烷組和溶劑組中PKCα，Nrf2和HO-1的表達顯著降低；與七氟烷組或溶劑組相比，川芎嗪組細胞中PKCα和HO-1的表達顯著升高，且細胞核中Nrf2的水平顯著增加。

注：Nrf2抗體以紅色顯示，核染色由藍色的4，6-二mid基-2苯基吲哚(DAPI)表示，合并的藍色和紅色染色表示Nrf2的核定位

表4 各組小鼠PKCα/Nrf2通路相關蛋白的相對表達水平

討 論

在4歲之前接受全身麻醉的兒童會通過抑制神經發育而引起長期神經認知損害，增加學習和記憶障礙風險[9-10]。最新的研究表明，氧化應激以及BBB通透性的異常增加是全身麻醉誘導的認知缺陷的關鍵[11]。然而，目前臨床上缺乏有效的神經保護劑以防止氧化損傷改善血腦屏障通透性。傳統中醫理論以“正氣存內而外邪不可干”為中心，講究通過調整患者的內環境以減輕手術麻醉所引起的損傷，緩解西藥麻醉誘發的氣血傷害。川芎嗪是一種傳統中藥，是從傘形科藁本屬植物川芎中分離提純的生物堿單體,是中藥川芎的主要有效成分，具有補氣益血，平補陰陽，補肝行血的效果，進而讓患者的臟腑功能得到恢復，發揮廣泛的神經保護作用。最近的研究報道全身麻醉相關的神經毒性對發育中的大腦的影響，包括氧化應激，不成對的突觸形成，甚至是長期的行為缺陷，而腹腔內注射劑量為10 mg/kg的川芎嗪可起到神經保護劑的作用[12]。在本研究中，川芎嗪治療可有效恢復七氟烷導致的海馬損傷大鼠海馬結構和功能的損傷，恢復大腦皮層BBB的生理狀態。先前的研究證實，在1.5%的七氟烷中暴露3 h會誘發認知缺陷[13]。我們的結果表明暴露于1.5%的七氟烷中暴露3 h會導致大鼠線粒體形態發生顯著改變，而川芎嗪治療可減輕病理改變，表明川芎嗪在預防和治療七氟烷引起的海馬損傷的臨床應用中的潛在價值。

在哺乳動物大腦發育過程中，氧化應激在常用麻醉劑引起的神經元變性中起重要作用。一些研究指出七氟烷可以在血液中產生不同濃度的三氟乙酸，從而增加ROS的積累并抑制抗氧化酶例如SOD，GSH和MDA的表達，增加自由基濃度以及氧化應激誘導的細胞毒性[14]。在我們的研究中，氧化應激相關指標的結果表明，暴露于1.5%的七氟烷3 h會引起海馬組織的氧化應激，而川芎嗪顯著降低ROS和MDA的水平，并明顯增加SOD和GSH的活性。表明川芎嗪可以通過上調抗氧化酶的表達來清除活性氧，減輕神經元細胞的病理損傷，從而保護海馬，證明川芎嗪具有緩解七氟烷引起的海馬氧化應激的能力。

基質金屬蛋白酶(MMPs)是鋅依賴性內肽酶家族，可以在氧化應激條件下被異常激活，從而降解基底膜和細胞外基質成分，而MMP受金屬蛋白酶的特定內源性組織抑制劑(包括TIMP-1，TIMP-2，TIMP-3和TIMP-4)嚴格調節。研究指出MMP-2和MMP-9可在麻醉條件下被誘導增加，并通過介導的ZO-1的降解破壞BBB[15]，并表現為BBB開放血清標志物S100β的顯著增加。在本研究中，蛋白質印跡的結果表明七氟烷處理對TIMP-1，TIMP-2的活性無明顯影響，但能明顯增加MMP-2和MMP-9的表達，從而誘導ZO-1的降解，并變現為S100β水平的明顯增加，提示七氟烷處理能夠以非TIMP依賴的方式上調MMP-2和MMP-9水平，導致BBB功能的損傷。

據報道，PKC信號通路與海馬中麻醉相關的神經變性抑制以及BBB通透性異常改變密切相關。血腦屏障(BBB)是高度分化的結構，由緊密連接的腦血管內皮細胞單層構成，并通過緊密連接(TJ)以及輔助蛋白(ZO)連接在連接復合體上，可以有效地阻止大分子及有毒物質的滲透[16-19]。研究指出，PKC抑制可以上調明膠酶表達，從而誘導BBB正常功能狀態敏感性指標ZO-1蛋白的降解增加，導致BBB通透性的改變[20-21]；此外，PKC激活可以磷酸化Nrf2，使Nrf2與Keap1分離，導致其易位至細胞核，誘導HO-1和其他抗氧化酶例如SOD和GSH的表達并防止氧化應激[22-24]；在本研究中，蛋白質印跡的結果表明川芎嗪可以激活PKCα/Nrf2信號通路發揮抗氧化作用，并通過抑制明膠酶介導的ZO-1的降解，增加ZO-1蛋白的表達，改善BBB的功能狀態；而IHC和IF的結果表明，川芎嗪顯著增加核Nrf2表達，并誘導HO-1過表達，表明川芎嗪可以激活PKCα/Nrf2信號通路，促進Nrf2的核轉運，并誘導Nrf2下游的抗氧化酶HO-1的表達，從而減少七氟烷引起的氧化應激和隨后的海馬損傷。此外，雖然我們的數據表明在一定程度上七氟烷可以激活PKCα/Nrf2信號通路，但是SOD和GSH等下游因素并未得到明顯改善?？赡苁且驗槁樽頃茐捏w內氧化和抗氧化的平衡，而氧化應激與保護機制之間的平衡是通過復雜的細胞生理學維持的，平衡障礙時則會導致氧化還原穩態異常并產生病理損傷。

總之，我們的結果表明，七氟烷可通過海馬組織中的氧化應激引起損傷，并通過MMP-2和MMP-9的表達以及明膠酶活性增加誘導ZO-1的降解，破壞BBB功能狀態，而川芎嗪可以通過激活PKCα/Nrf2信號通路，抑制明膠酶活性，增加ZO-1的表達，改善BBB通透性，并通過誘導抗氧化酶的表達，進而降低海馬體的氧化應激，有效地保護海馬免受氧化應激的傷害，改善海馬體組織病理學結構。