阿法替尼和塞瑞替尼微生物限度檢查方法驗證

張光華，李玉立，劉文杰，牛振東，江志杰

（北京市藥品檢驗所中藥成分分析與生物評價北京市重點實驗室，北京 102206）

阿法替尼是新一代口服小分子酪氨酸激酶抑制劑（TKI），可關閉癌細胞信號通路、抑制腫瘤生長，主要用于非小細胞肺癌（NSCLC）的治療。塞瑞替尼是間變性淋巴瘤激酶（ALK）抑制劑，用于一線治療ALK+轉移性NSCLC。2015 年版《中國藥典（四部）》通則1107［1］非無菌藥品微生物限度標準規定，口服片劑、膠囊劑需氧菌總數不得超過103cfu/g，霉菌和酵母菌總數不得超過102cfu/g，1 g 中不得檢出大腸埃希菌。本研究中按照2015 年版《中國藥典（四部）》通則1105 和通則1106［1］的要求，綜合考慮消除抑菌性及簡便易操作等因素，建立了適合阿法替尼片、塞瑞替尼膠囊的微生物限度檢查方法，并對3 批產品進行方法適用性試驗。現報道如下。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LRH-250 型生化培養箱（上海一恒科學儀器有限公司）；XG1.DMXD-0.36 型電熱脈動真空滅菌器（山東新華醫療器械股份有限公司）；1300SERIESA2 型生物安全柜（Thermo Fisher Scientific 公司）；ML1602 型電子天平（梅特勒公司，精度為0.01 g）；SHKE 6000-1CE型恒溫搖床（Thermo Scientific 公司）。

1.2 藥品

阿法替尼片（S1，Boehringer Ingelheim Pharma GmbH& Co.KG 公 司，批 號 分 別 為 202525U，306342，305921B，編號分別為1，2，3，規格為每片50 mg）；塞瑞替尼膠囊（S2，Novartis Pharma Stein AG 公司，批號分別為S0009D，S0011，S0010A，編號分別為1，2，3，規格為每粒150 mg）。

1.3 試驗菌種

枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis［CMCC（B）63501］，銅 綠 假 單 胞 菌 Pseudomonas aeruginosa［CMCC（B）10104］，金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus［CMCC（B）26003］，大 腸 埃 希 菌 Escherichia coli［CMCC（B）44102］，白 色 念 珠 菌 Candida albicans［CMCC（F）98001］，黑曲霉Aspergillus niger［CMCC（F）98003］，均購自中國食品藥品檢定研究院，菌株傳代數為第3 代。

1.4 培養基和試劑

胰酪大豆胨液體培養基（TSB），胰酪大豆胨瓊脂培養基（TSA），沙氏葡萄糖液體培養基（SDB），沙氏葡萄糖瓊脂培養基（SDA），均購自美國BD 公司；pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，麥康凱液體培養基，麥康凱瓊脂培養基，均購自北京奧博星生物技術有限責任公司；吐溫80（國藥集團化學試劑有限公司）；卵磷脂（Sigma 公司）。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

2.1.1 菌液制備按2015 年版《中國藥典（四部）》通則1105［1］微生物計數法制備菌液。

2.1.2 供試液制備

取供試品S1 和S2 各10 g，分別置100 mL 錐形瓶中，加pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至刻度，充分振搖，制成1 ∶10 的供試液S1A 和S2A。取1 ∶10 的供試液1 mL，置pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液9 mL中，即得1 ∶100 的供試液S1A 和S2A。

取供試品S1 和S2 各10 g，分別置100 mL 錐形瓶中，加入含有3%吐溫80 和0.3% 卵磷脂的pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至刻度，充分振搖，制成1 ∶10 的供試液S1B 和S2B。取1 ∶10 的供試液1 mL，置含3%吐溫80 和0.3% 卵磷脂的pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液9 mL 中，即得1 ∶100 的供試液S1B 和S2B。

2.2 培養基適用性檢查

培養基均在驗證合格的滅菌程序下滅菌，按2015年版《中國藥典（四部）》通則1105［1］微生物計數法中培養基的適用性檢查方法進行，結果均符合要求。

2.3 微生物計數方法抑菌性篩查試驗

2.3.1 常規稀釋劑1 ∶10 供試液和1 ∶100 供試液

菌液對照組：取pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液9.9 mL，加入制備好的試驗菌液0.1 mL（細菌、酵母菌500～1 000 cfu，霉菌300～600 cfu），混勻，使每1 mL稀釋液中含菌量為30～100 cfu。分別取上述菌懸液1 mL注入平皿中，測定每1 mL 的活菌數。

供試品對照組：取1∶10 供試液S1A 和S2A 各9.9mL，分別加入稀釋劑0.1 mL，混勻，取1 mL 注入平皿中，測定供試品的需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數。取1 ∶100供試液S1A 和S2A 各9.9 mL，分別加入稀釋劑0.1 mL，混勻，取1 mL 注入平皿中，測定其需氧菌總數。

試驗組：取1 ∶10 的供試液S1A 和S2A 9.9 mL 各5 份，分別加入制備好的試驗菌液0.1 mL，混勻，取1 mL注入平皿中，測定需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數。取1 ∶100 供試液S1A 和S2A 9.9 mL 各5 份，分別加入制備好的試驗菌液0.1 mL，混勻，取1 mL 注入平皿中，測定需氧菌總數。

檢測方法：需氧菌總數測定用TSA，置33 ℃培養5 d，逐日觀察結果；霉菌和酵母菌總數測定用SDA，置23 ℃培養7 d，逐日觀察結果。

結果分析：結果見表1。可見，S1A 的微生物計數采用1 ∶10 和1 ∶100 供試液用平皿法檢查，枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的回收比值均為0，表明S1A 的1 ∶10和1 ∶100 供試液對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌有抑菌性，該方法不適合S1 的需氧菌總數計數。S1A 的1 ∶10 供試液白色念珠菌（SDA）和黑曲霉（SDA）的回收比值在0.5～2.0 范圍內，該方法適合S1 的霉菌和酵母菌總數計數。S2A 的微生物計數采用1 ∶10 和1 ∶100 供試液用平皿法檢查，枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的回收比值均為0，白色念珠菌的回收比值為0 和0.14，表明S2A 的1 ∶10 和1 ∶100 供試液對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌有抑菌性，該方法不適合S2 的需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數計數。

表1 S1A 和S2A 微生物計數抑菌性篩查試驗結果

2.3.2 稀釋劑添加3%吐溫80 和0.3%卵磷脂用于驗證2.3.1 項下回收比值小于0.5 的供試液。菌液對照組：同2.3.1 項下菌液對照組。

供試品對照組：取1 ∶10 供試液S2B 9.9 mL，加入稀釋劑0.1 mL，混勻，取1 mL 注入平皿中，測定供試品的霉菌和酵母菌總數；取1 ∶100 供試液S1B 和S2B 9.9 mL，分別加入稀釋劑0.1 mL，混勻，取1 mL 注入平皿中，測定供試品的需氧菌總數。

試驗組：取1 ∶10 供試液S2B 9.9 mL，加入制備好的白色念珠菌試驗菌液0.1 mL，混勻，取1 mL 注入平皿中，測定霉菌和酵母菌總數；取1 ∶100 供試液S1B和S2B 9.9 mL 各5 份，分別加入制備好的試驗菌液0.1 mL，混勻，取1 mL 注入平皿中，測定需氧菌總數。

檢測方法：需氧菌總數測定用TSA，置33 ℃培養5 d，逐日觀察結果；霉菌和酵母菌總數測定用SDA，置23 ℃培養7 d，逐日觀察結果。

結果分析：結果見表2。可見，S1B 的需氧菌總數計數采用1 ∶100 供試液用平皿法檢查，枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的回收比值均在0.5～2.0 范圍內，表明S1B 的1 ∶100 供試液對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌性已消除，該方法適合S1 的需氧菌總數計數。S2B 的需氧菌總數計數采用1 ∶100 供試液用平皿法檢查，枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的回收比值均小于0.5，表明S2B 的1 ∶100 供試液對枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌有抑菌性，該方法不適合S2 的需氧菌總數計數。S2B 的霉菌和酵母菌數總數計數采用1 ∶10 供試液用平皿法檢查，白色念珠菌的回收比值小于0.5，表明S2B 的1 ∶10 供試液對白色念珠菌有抑菌性，該方法不適合S2 的霉菌和酵母菌總數計數。

2.3.3 稀釋劑和培養基均添加3%吐溫80 和0.3%卵磷脂

用于驗證2.3.2 項下回收比值小于0.5 的供試液。

菌液對照組：同2.3.1 項下菌液對照組。

供試品對照組：取1 ∶10 供試液S2B 9.9 mL，加入稀釋劑0.1 mL，混勻，取1 mL 注入平皿中，測定供試品的霉菌和酵母菌總數。取1 ∶100 供試液S2B 9.9 mL，加入稀釋劑0.1 mL，混勻，取1 mL 注入平皿中，測定供試品的需氧菌總數。

試驗組：取1 ∶10 供試液S2B 9.9 mL，加入制備好的白色念珠菌試驗菌液0.1 mL，混勻，取1 mL 注入平皿中，測定霉菌和酵母菌總數。取1 ∶100 供試液S2B 9.9 mL 各5 份，分別加入制備好的試驗菌液0.1 mL，混勻，取1 mL 注入平皿中，測定需氧菌總數。

檢測方法：需氧菌總數測定用含3%吐溫80 和0.3% 卵磷脂的TSA，置33 ℃培養5 d，逐日觀察結果；霉菌和酵母菌總數測定用含3%吐溫80 和0.3% 卵磷脂的SDA，置23 ℃培養7 d，逐日觀察結果。

測定結果：結果見表3。可見，S2B 的需氧菌總數計數采用1 ∶100 供試液用平皿法檢查，培養基用含3%吐溫80 和0.3% 卵磷脂的TSA，枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的回收比值均在0.5～2.0 范圍內，表明S2B的1 ∶100 供試液對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌性已消除，該方法適合S2 的需氧菌總數計數。S2B的霉菌和酵母菌數總數計數采用1 ∶10 供試液用平皿法檢查，培養基用含3% 吐溫80 和0.3% 卵磷脂的SDA，白色念珠菌的回收比值在0.5～2.0 范圍內，表明S2B 的1 ∶10 供試液對白色念珠菌的抑菌性已消除，該方法適合S2 的霉菌和酵母菌總數計數。

2.4 微生物計數方法適用性試驗

菌液組：取pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液9.9 mL，加入制備好的試驗菌液0.1 mL（細菌、酵母菌500～1 000 cfu，霉菌300～600 cfu），混勻，使每1 mL 稀釋液中含菌30～100 cfu。分別取1 mL 注入平皿，測定每1 mL 的活菌數。

供試品對照組：取S1B 和S2B 的1 ∶100 供試液9.9 mL，分別加入稀釋劑0.1 mL，混勻，取1 mL 注入平皿，測定供試品的需氧菌總數；取S1B 和S2B 的1 ∶10供試液9.9 mL，加入稀釋劑0.1 mL，混勻，取1 mL 注入平皿，測定其霉菌和酵母菌總數。

試驗組：分別取S1B 和S2B 的1 ∶100 供試液9.9 mL各5 份，加制備好的試驗菌液0.1 mL，混勻，取1 mL 注入平皿，測定需氧菌總數。分別取S1B 和S2B 的1 ∶10供試液9.9 mL 各2 份，加制備好的真菌菌液0.1 mL，混勻，取1 mL 注入平皿，測定霉菌和酵母菌數。

稀釋劑對照組：分別取含3%吐溫80 和0.3% 卵磷脂的pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液9.9 mL 5 份，加入制備好的試驗菌液0.1 mL（300～1 000 cfu），混勻，取1 mL 注入平皿，測定每1 mL 的活菌數。

添加中和劑的培養基對照組：分別取菌液組制備好的菌液1mL 注入平皿，測定需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數。

檢測方法：上述已注入供試液的平皿，S1 需氧菌總數測定傾注TSA，霉菌和酵母菌總數測定傾注SDA。S2及添加中和劑的培養基對照組，需氧菌總數測定傾注含3%吐溫80 和0.3%卵磷脂的TSA，霉菌和酵母菌總數測定傾注含3%吐溫80 和0.3%卵磷脂的SDA。需氧菌總數測定置33 ℃培養5 d，逐日觀察結果；霉菌和酵母菌總數測定置23 ℃培養7 d，逐日觀察結果。

結果分析：結果見表4。可見，稀釋劑對照組回收比值均在0.5～2.0 范圍內，表明含3%吐溫80 和0.3%卵磷脂的pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液對微生物無毒性［3-4］。S1 和S2 枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉菌的回收比值均在0.5～2.0 范圍內，提示3%吐溫80 和0.3% 卵磷脂在本研究中的有效性［3-4］，該方法進行S1 和S2 的需氧菌總數計數、霉菌和酵母菌總數計數方法準確、可行。

表4 S1 和S2 微生物計數方法適用性試驗結果（n=3）

2.5 控制菌檢查方法適用性試驗

供試品對照組：取S1B 和S2B 的1 ∶10 供試液10 mL，分別加入TSB 100 mL 中，33 ℃培養24 h。

陰性對照組：取稀釋液10 mL，置TSB 100 mL 中，33 ℃培養24 h。

陽性對照組：取S1B 和S2B 的1 ∶10 供試液10 mL，分別加入TSB 100 mL 中，再加入不大于100 cfu 的大腸埃希菌，33 ℃培養24 h。

檢測方法：分別取上述預培養物1 mL，加入麥康凱液體培養基100 mL 中，42 ℃培養24 h 后，再分別劃線于麥康凱瓊脂平板上，33 ℃培養24 h，觀察結果。

結果分析：結果見表5。可見，S1 和S2 陽性對照菌生長良好，表明S1 和S2 在該條件下對大腸埃希菌無抑菌作用或其抑菌作用可忽略不計。表明采用該方法進行S1 和S2 的大腸埃希菌檢查方法可行。

表5 控制菌檢查方法適用性試驗結果

3 討論

3.1 中和劑吐溫80 和卵磷脂的應用

吐溫80 和卵磷脂是《中國藥典》《歐洲藥典》收載的常用中和劑，可添加至稀釋劑或培養基中［1-2］。試驗證明，3%吐溫80 和0.3% 卵磷脂對微生物無毒性。吐溫80為非離子表面活性劑，卵磷脂為兩性離子表面活性劑，均可降低季銨類化合物、酚、醛、對羥基苯甲酸類、二重雙肌類、碘酒、洗必泰類、石炭酸類藥物的活性［3］。卵磷脂是細胞膜上最主要的脂質，其脂肪酸種類會影響細胞的流動性及通透性；通過影響細胞膜上許多酵素的功能來調控細胞生長；可改變細胞膜功能，是細胞膜修復的營養劑。3%吐溫80 和0.3% 卵磷脂對部分有抑菌作用化學藥可作為中和劑，可降低抑菌作用［3-6］。

3.2 微生物限度檢查方法的確立

阿法替尼片：取供試品10 g，加含3%吐溫80 和0.3% 卵磷脂的pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL，充分振搖，制成1 ∶10 的供試液，取1 ∶10 供試液1 mL，置含3%吐溫80 和0.3% 卵磷脂的pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液9 mL 中，即為1 ∶100 的供試液。需氧菌總數計數取1 ∶100 供試液1 mL 注入平皿，按2015 年版《中國藥典》通則1105 方法檢查；霉菌和酵母菌總數計數，取1 ∶10 供試液1 mL 注入平皿，按2015 年版《中國藥典》通則1105 方法檢查。大腸埃希菌檢查，取1 ∶10 供試液10 mL，置TSA 100 mL 中，按2015 年版《中國藥典》通則1106 方法檢查。

塞瑞替尼膠囊：取供試品10 g，加入含3%吐溫80和0.3% 卵磷脂的pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL，充分振搖，制成1 ∶10 的供試液，取1 ∶10 供試液1 mL，置含3%吐溫80 和0.3% 卵磷脂的pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液9 mL 中，即得1 ∶100 的供試液。需氧菌總數計數取1 ∶100 供試液1 mL 注入平皿，培養基為含3%吐溫80 和0.3% 卵磷脂的TSA，按2015 年版《中國藥典》通則1105 方法檢查；霉菌和酵母菌總數計數，取1 ∶10 供試液1 mL 注皿，培養基為含3%吐溫80 和0.3% 卵磷脂的SDA，按2015 年版《中國藥典》通則1105 方法檢查；大腸埃希菌檢查，取1 ∶10供試液10 mL，置TSB 100 mL 中，按2015 年版《中國藥典》通則1106 方法檢查。

3.3 替尼類抗癌藥物的微生物檢查方法建立的思路

替尼類抗癌藥物對微生物都有一定的抑菌作用，尤其是對細菌。抑菌性篩查試驗結果也表明，S1 和S2 對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌均有很強的抑菌作用。建議可直接采用含3%吐溫80 和0.3%卵磷脂的稀釋液，如1 ∶10 供試液的回收率低于《中國藥典》要求，直接采用1 ∶100 供試液進行試驗，抑菌性更強的可選擇在培養基中添加3%吐溫80 和0.3% 卵磷脂。本研究中的2 種替尼類抗癌藥物，通過稀釋法和中和法，均消除了其抑菌作用，符合《中國藥典》的相關規定，可用于產品的質量控制，并為口服替尼類抗癌藥物的微生物限度的檢查提供了參考。