水稻超大籽粒形成的重要基因和調(diào)控通路的轉(zhuǎn)錄組分析

梁文化, 孫旭超, 岳紅亮, 田 錚, 陳 濤, 趙慶勇, 朱 鎮(zhèn), 趙 凌, 趙春芳,姚 姝, 路 凱, 王才林, 張亞?wèn)|

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所/江蘇省優(yōu)質(zhì)水稻工程技術(shù)研究中心/國(guó)家水稻改良中心南京分中心,江蘇 南京 210014)

水稻粒型包括粒長(zhǎng)、粒寬和粒厚等3個(gè)基本要素,是影響水稻產(chǎn)量和品質(zhì)的重要農(nóng)藝性狀[1-2],因此粒型基因的發(fā)掘和利用一直倍受重視。目前人們已經(jīng)在水稻中定位了400多個(gè)與粒型相關(guān)的數(shù)量性狀座位(Quantitative trait locus, QTL),克隆的粒型基因已經(jīng)超過(guò)60個(gè),其中控制粒長(zhǎng)的基因有GS3、GL3.1/qGL3、GLW7、TGW3、OsMADS1、GS9等[3-9]，控制粒寬的基因有GW2、GW5/qSW5、GS5、GW7/GL7、GW8等[10-16]，控制粒厚的基因有WTG1[17-18]。以上研究結(jié)果證實(shí),通過(guò)調(diào)節(jié)水稻的籽粒性狀可以增加水稻千粒質(zhì)量,從而提高水稻產(chǎn)量。

GS3是水稻中控制粒長(zhǎng)、粒質(zhì)量的重要基因,對(duì)粒寬、粒厚也有一定影響,全長(zhǎng)的GS3基因編碼1個(gè)跨膜蛋白,是G蛋白的γ亞基之一,在水稻幼穗中高表達(dá)[3,19-20]。qGL3/GL3.1基因編碼含有2個(gè)Kelch功能域的蛋白磷酸酶OsPPKL1,在幼穗中表達(dá)量較高,通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期蛋白T1;3來(lái)控制穎殼的細(xì)胞分裂,最終影響水稻籽粒大小[4-5]。GW2是控制水稻粒寬和粒質(zhì)量的主效基因,在水稻各組織中都表達(dá),該基因編碼1個(gè)環(huán)型E3泛素連接酶,通過(guò)泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解途徑負(fù)調(diào)控細(xì)胞分裂[10]。qSW5/GW5基因編碼鈣調(diào)素結(jié)合蛋白,對(duì)水稻粒寬、粒質(zhì)量有顯著影響，qSW5/GW5基因在水稻各個(gè)組織、器官中都表達(dá),在幼穗中表達(dá)量最高[11-12,21]。GS5基因是控制水稻粒寬、粒質(zhì)量和充實(shí)度的主效QTL,在幼穗中表達(dá)量較高,通過(guò)促進(jìn)外稃/內(nèi)稃細(xì)胞分裂和細(xì)胞膨脹而正調(diào)控水稻籽粒的大小[13,22]。GW7/GL7基因編碼擬南芥LONGIFOLIA蛋白的同源蛋白,在水稻幼穗和分生組織中高表達(dá),通過(guò)調(diào)控谷粒的細(xì)胞分裂而影響粒型[14-15]。GW8是1個(gè)SBP(Squamosa promoter binding protein)家族的轉(zhuǎn)錄因子,在7 cm長(zhǎng)的水稻幼穗中表達(dá)量最高,該基因的高表達(dá)會(huì)促進(jìn)細(xì)胞增殖和籽粒灌漿,從而使籽粒變寬,進(jìn)而提高產(chǎn)量,GW8基因與GW7基因的啟動(dòng)子結(jié)合并抑制GW7基因的表達(dá)[16]。

本研究中的水稻材料TD70是來(lái)源于天鵝谷///9520//(72-496/蘇御糯)后代粒質(zhì)量超雙親的超大粒穩(wěn)定品系,Kasalath為印度的常規(guī)秈稻品種,2012年正季在南京種植的TD70千粒質(zhì)量為65.0 g,Kasalath千粒質(zhì)量為17.4 g[23]。在前期的研究中,筆者利用TD70與小粒秈稻Kasalath構(gòu)建了重組自交系(RIL)群體,共檢測(cè)到19個(gè)穩(wěn)定遺傳的粒型相關(guān)QTL,這些QTL區(qū)間包含GS3、qGL3、GW2、qSW5/GW5、GS5、GW7及GW8共7個(gè)已克隆的粒型基因位點(diǎn),遺傳效應(yīng)分析結(jié)果表明,TD70中這些粒型基因位點(diǎn)對(duì)水稻籽粒大小具有正向作用,Kasalath中不含有這些粒型基因的增效位點(diǎn)；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),TD70中不同粒型的基因組合對(duì)籽粒大小具有累加效應(yīng)[24-26]。由此可見(jiàn),多個(gè)粒型基因的聚合是TD70具有超大籽粒的原因,然而在多個(gè)粒型基因聚合后,水稻孕穗期幼穗表達(dá)譜中穗發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)和代謝通路的變化并不清晰。

近年來(lái),轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-Seq)技術(shù)已經(jīng)成為研究表達(dá)譜的有力工具,研究者利用RNA-Seq技術(shù)在水稻的育性、穗發(fā)育、耐鹽、耐熱等方面展開(kāi)了相關(guān)研究[27-33]。為了研究水稻粒型相關(guān)基因孕穗期在幼穗發(fā)育中的調(diào)控機(jī)制,本研究對(duì)超大粒粳稻TD70和小粒秈稻Kasalath孕穗期不同階段的幼穗進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。通過(guò)對(duì)差異表達(dá)基因的基因本體(Gene ontology, GO)富集和代謝通路的分析,從基因表達(dá)水平、代謝通路的變化方面對(duì)大粒水稻品種形成的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行解析,以期為在水稻育種中高效利用粒型基因奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料的種植與取樣

大粒粳稻品系TD70為天鵝谷///9520//(72-496/蘇御糯)的后代,是本研究團(tuán)隊(duì)自主創(chuàng)制的穩(wěn)定品系；Kasalath是印度的一個(gè)常規(guī)秈稻品種,由江蘇省種質(zhì)資源保護(hù)與利用平臺(tái)提供。以上材料于2018年種植于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)田中,于2018年5月12日播種,6月12日移栽,每個(gè)小區(qū)種植4行,每行10株,株距為13.5 cm,行距為26.5 cm,每個(gè)品種種植3個(gè)小區(qū),采用常規(guī)栽培和管理措施。研究發(fā)現(xiàn),粒型相關(guān)基因在水稻幼穗中的表達(dá)比較活躍[5-7]。為了全面分析水稻抽穗前幼穗發(fā)育不同階段表達(dá)譜的變化,筆者在水稻孕穗期取3個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的幼穗[分別記作P1(幼穗長(zhǎng)度為1～3 cm)、P2(幼穗長(zhǎng)度為4～7 cm)、P3(幼穗長(zhǎng)度為8～10 cm)]進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,每個(gè)時(shí)期的樣品取3個(gè)生物學(xué)重復(fù),共18個(gè)幼穗樣本。幼穗樣品分離后立即置于液氮中速凍,于-80 ℃保存至RNA提取。

1.2 成熟種子粒型相關(guān)性狀的測(cè)定

分別取5株成熟TD70、Kasalath單株的種子。每個(gè)單株隨機(jī)挑選10粒飽滿(mǎn)的種子,使用游標(biāo)卡尺(精度為0.01 mm)測(cè)量種子粒長(zhǎng)、粒寬和粒厚,千粒質(zhì)量(即單株水稻1 000粒風(fēng)干種子的質(zhì)量)用電子天平(精度0.001 g)測(cè)定。每個(gè)性狀以5株水稻所測(cè)平均值作為最終數(shù)值。

1.3 RNA提取、文庫(kù)構(gòu)建及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

使用TRIzol?RNA Purification Kit (Invitrogen)對(duì)水稻幼穗組織進(jìn)行總RNA的提取,并用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。使用NanoDrop 2000、Qubit2.0、Agilent 2100分別對(duì)RNA進(jìn)行純度、濃度、完整性檢測(cè)。以mRNA為模板,利用AMPure XP beads試劑盒對(duì)RNA進(jìn)行純化、打斷、修復(fù)、片段選擇、PCR富集等操作,構(gòu)建cDNA文庫(kù)。對(duì)于質(zhì)量檢測(cè)合格的文庫(kù),由安諾優(yōu)達(dá)基因科技(北京)有限公司使用Illumina公司的NovaSeq 6000平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序模式為Paired-end 150 bp。

1.4 測(cè)序數(shù)據(jù)分析

原始數(shù)據(jù)下機(jī)后,首先用fastQC(Ver 0.11.9)進(jìn)行測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量檢測(cè)與評(píng)估；原始測(cè)序數(shù)據(jù)中的接頭和低質(zhì)量序列,采用軟件fastp(Ver 0.20.0)進(jìn)行處理,設(shè)定參數(shù)保證兩端序列的最小長(zhǎng)度均≥50 bp,進(jìn)而獲得高質(zhì)量的干凈讀長(zhǎng)(clean reads)。本研究基于日本晴(Nipponbare)水稻參考基因組(http://plants.ensembl.org/index.html,IRGSP-1.0),按照Trapnell等已發(fā)表的轉(zhuǎn)錄組分析的經(jīng)典流程進(jìn)行數(shù)據(jù)分析[34]。首先,用軟件包Tophat2(Ver 2.1.1)將得到的clean reads與參考基因組進(jìn)行比對(duì)[34-35],進(jìn)一步利用Samtools(Ver 1.6)軟件獲得特異性比對(duì)結(jié)果[36]。然后,基于Tophat 2比對(duì)的結(jié)果,使用Cufflinks(Ver 2.2.1)軟件包進(jìn)行基因表達(dá)量的計(jì)算和差異基因的尋找。采用FPKM(Fragments per kilobase of transcript per million fragments mapped)評(píng)價(jià)每個(gè)基因的表達(dá)豐度,同時(shí)過(guò)濾多個(gè)樣本中FPKM<1的假陽(yáng)性轉(zhuǎn)錄本。進(jìn)一步利用軟件Cuffdiff(Ver 2.2.1)對(duì)水稻幼穗不同發(fā)育階段的差異表達(dá)基因(Differentially expressed genes, DEGs)進(jìn)行鑒定,差異表達(dá)基因的篩選條件如下：log2(fold change)≥1(fold change代表某個(gè)基因在2個(gè)材料中的表達(dá)量),q值<0.05[34]。將DEGs與美國(guó)國(guó)家生物信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)網(wǎng)站上的nr蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì),預(yù)測(cè)其基因功能,然后利用GO、KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行功能分類(lèi)和代謝途徑的富集分析。

1.5 熒光定量PCR(qRT-PCR)驗(yàn)證

利用qRT-PCR定量技術(shù)分析部分差異表達(dá)基因的表達(dá)豐度。使用Primer Premier(Ver 5.0)軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì),16個(gè)基因的引物序列見(jiàn)表1。用與RNA-Seq建庫(kù)同批次的RNA進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。使用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix kit (TransGen Biotech)進(jìn)行cDNA第一鏈合成。定量PCR在ABI Step One Plus Real-Time PCR System (Applied Biosystems)上進(jìn)行,使用的試劑為SYBR PremixExTaqTMRT-PCR kit (TaKaRa)。以水稻基因OsActin-1[基因識(shí)別號(hào)(ID)：Os03g0718100]作為內(nèi)標(biāo),通過(guò)相對(duì)定量的方法獲得測(cè)定值[37]。

2 結(jié)果與分析

2.1 TD70與Kasalath的粒型分析

研究發(fā)現(xiàn),特大粒水稻品系TD70中聚合了GS3、qGL3、GW2、qSW5/GW5、GS5、GW7及GW8共7個(gè)對(duì)籽粒大小具有正向效應(yīng)的粒型基因；小粒秈稻Kasalath中不含有上述基因[24-26]。于2018年正季測(cè)定成熟水稻的籽粒大小,由圖1可以看出,TD70平均粒長(zhǎng)11.78 mm,粒寬4.49 mm,粒厚2.99 mm,千粒質(zhì)量66.72 g,其千粒質(zhì)量顯著高于Kasalath(17.94 g)。t檢驗(yàn)結(jié)果表明,TD70的粒長(zhǎng)、粒寬、粒厚及千粒質(zhì)量均高于Kasalath,2份材料之間的差異達(dá)到極顯著水平(P<0.01)；而TD70的長(zhǎng)寬比則小于Kasalath,二者之間的差異也達(dá)到極顯著水平(P<0.01)。由此可見(jiàn),多個(gè)粒型基因的聚合增加了水稻粒長(zhǎng)、粒寬和粒厚,從而產(chǎn)生了超大籽粒,進(jìn)而提高了千粒質(zhì)量。

表1 用于qRT-PCR表達(dá)分析的引物序列

A：籽粒形態(tài)特征；B：粒長(zhǎng)；C：粒寬；D：粒厚；E：長(zhǎng)寬比；F：千粒質(zhì)量；各表型特征圖中的**表示經(jīng)t檢驗(yàn),2個(gè)材料間存在極顯著差異(P<0.01)。圖1 TD70和Kasalath的籽粒表型特征差異Fig.1 Differences of grains phenotypic characteristics between TD70 and Kasalath

2.2 2個(gè)水稻材料幼穗中轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及序列比對(duì)

本研究通過(guò)對(duì)2個(gè)水稻材料的18個(gè)水稻幼穗樣本測(cè)序文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序,得到的原始read數(shù)共為857 017 092條,平均每個(gè)測(cè)序文庫(kù)得到47 612 061條原始read。進(jìn)行去除接頭、去污染和去低質(zhì)量處理后,平均每個(gè)測(cè)序文庫(kù)獲得的clean read數(shù)量為45 474 692條。通過(guò)FastQC軟件對(duì)clean數(shù)據(jù)的測(cè)序質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明,18個(gè)測(cè)序文庫(kù)堿基的Q30(測(cè)序堿基準(zhǔn)確率為99.9%的read)比例最低為91.9%,最高為93.0%,平均為92.2%,可見(jiàn)測(cè)序質(zhì)量較高。利用Tophat軟件包將測(cè)序得到的每個(gè)clean數(shù)據(jù)回貼到參考基因組中。從表2可以看出,clean數(shù)據(jù)比對(duì)到參考基因組的最低概率為83.2%,最高達(dá)到90.9%。特異性比對(duì)(Unique alignment)到日本晴基因組中唯一位點(diǎn)的概率為74.4%～85.1%,平均為79.9%。TD70比對(duì)到參考基因組的概率明顯高于Kasalath,這可能是秈粳稻之間基因組的差異造成的。

表2 測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及與水稻幼穗中基因組比對(duì)

2.3 2個(gè)水稻材料幼穗中轉(zhuǎn)錄組的整體分析

為了分析TD70和Kasalath在水稻孕穗期幼穗中表達(dá)譜的動(dòng)態(tài)差異,筆者對(duì)至少在1個(gè)樣本中表達(dá)的基因進(jìn)行斯皮爾曼相關(guān)系數(shù)(Sppanicleman correlation coefficient, SCC)分析和主成分分析(Principal component analysis, PCA)。結(jié)果顯示,每個(gè)樣本的3個(gè)生物學(xué)重復(fù)間的最低相關(guān)系數(shù)為0. 947 2,說(shuō)明測(cè)序樣本生物學(xué)重復(fù)具有較好的重現(xiàn)性。從圖2A可以看出,同一水稻材料不同時(shí)期的樣本間也存在相關(guān)性；2個(gè)水稻材料在相同發(fā)育時(shí)期的幼穗間存在一定差異；TD70中后期(P2和P3)的幼穗具有一定的相似性而與前期的差異較大,Kasalath也存在類(lèi)似的情況。由圖2B可以看出,2個(gè)水稻材料在早期(P1)幼穗中表達(dá)譜具有明顯差異；隨著水稻幼穗的發(fā)育,在中后期(P2、P3)幼穗中表達(dá)譜的差異進(jìn)一步擴(kuò)大,這暗示2個(gè)水稻材料在幼穗發(fā)育早期表達(dá)譜已經(jīng)出現(xiàn)差異,可能是造成后期水稻籽粒大小差異的原因。

2.4 2個(gè)水稻材料幼穗中差異表達(dá)基因分析

根據(jù)Cufdiff的檢測(cè)結(jié)果,設(shè)定差異表達(dá)基因的標(biāo)準(zhǔn)為q<0.05,差異表達(dá)倍數(shù)≥2,對(duì)TD70與Kasalath不同大小幼穗的3個(gè)比較組(TD70-P1/Kasalath-P1、TD70-P2/Kasalath-P2、TD70-P3/Kasalath-P3)進(jìn)行差異表達(dá)基因分析。結(jié)果顯示,P1期有3 618個(gè)差異表達(dá)基因,其中2 436個(gè)基因上調(diào)表達(dá),1 182個(gè)基因下調(diào)表達(dá)；P2期共獲得4 183個(gè)差異表達(dá)基因,其中2 368個(gè)基因上調(diào)表達(dá),1 815個(gè)基因下調(diào)表達(dá)；P3期獲得的差異表達(dá)基因數(shù)共5 254個(gè),其中2 426個(gè)基因上調(diào)表達(dá),2 828個(gè)基因下調(diào)表達(dá)。由圖3A可見(jiàn),隨著水稻幼穗的發(fā)育,2個(gè)材料間差異表達(dá)的基因數(shù)明顯增多,說(shuō)明后期有更多基因參與到小穗發(fā)育進(jìn)程中。從差異表達(dá)基因文氏圖(圖3B)看出,在3個(gè)時(shí)期都差異表達(dá)的基因有1 742個(gè),在P1、P2、P3時(shí)期特異的差異表達(dá)基因分別有1 055個(gè)、990個(gè)、2 096個(gè)。說(shuō)明水稻幼穗在不同發(fā)育時(shí)期的差異表達(dá)基因既有共性的，也有不同時(shí)期特異性的。

A：通過(guò)Sppanicleman相關(guān)系數(shù)計(jì)算3個(gè)生物學(xué)重復(fù)之間的相關(guān)性,比例尺中數(shù)據(jù)表示斯皮爾曼相關(guān)系數(shù)；B：主成分分析顯示TD70和Kasalath不同發(fā)育階段幼穗的轉(zhuǎn)錄組聚類(lèi)關(guān)系。圖A中，a:K-P1-1;b:K-P1-2;c:K-P1-3;d:K-P2-1;e:K-P2-2;f:K-P2-3;g:K-P3-1;h:K-P3-2;i:K-P3-3;j:T-P1-1;k:T-P1-2;l:T-P1-3;m:T-P2-1;n:T-P2-2;o:T-P2-3;p:T-P3-1;q:T-P3-2;r:T-P3-3。K：Kasalath；T：TD70；P1、P2、P3：孕穗期1～3 cm、4～7 cm、8～10 cm長(zhǎng)度的幼穗；1、2、3：樣本的3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。圖2 2個(gè)水稻材料幼穗發(fā)育不同階段轉(zhuǎn)錄組之間的相關(guān)性Fig.2 Correlation between transcriptomes of two rice materials at different young panicles development stages

A：TD70和Kasalath幼穗發(fā)育不同時(shí)期差異表達(dá)基因統(tǒng)計(jì)結(jié)果；B：差異表達(dá)基因在水稻幼穗發(fā)育3個(gè)時(shí)期的分布情況。K：Kasalath；T：TD70；P1、P2、P3：孕穗期1～3 cm、4～7 cm、8～10 cm長(zhǎng)度的幼穗；1、2、3：樣本的3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。圖3 2個(gè)水稻材料幼穗間差異表達(dá)基因的統(tǒng)計(jì)Fig.3 Statistics of differentially expressed genes between two rice materials

2.5 2個(gè)水稻材料幼穗中差異表達(dá)基因的qRT-PCR表達(dá)驗(yàn)證

從轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中選取16個(gè)基因,包括TD70中已知的7個(gè)粒型基因GS3、qGL3、GW2、qSW5/GW5、GS5、GW7和GW8。利用qRT-PCR分析這些基因在2個(gè)水稻材料不同發(fā)育時(shí)期幼穗中的相對(duì)表達(dá)水平,對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行可靠性驗(yàn)證。圖4顯示,16個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果與qRT-PCR結(jié)果一致,表明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果可靠。同時(shí),對(duì)粒型基因在不同發(fā)育時(shí)期幼穗中的表達(dá)模式進(jìn)行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),qGL3基因在TD70幼穗發(fā)育早期下調(diào)表達(dá),隨著幼穗的發(fā)育,在中后期表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá)；GW7、GW8基因在TD70幼穗發(fā)育過(guò)程中始終上調(diào)表達(dá)；其余4個(gè)粒型基因在Kasalath 3個(gè)幼穗發(fā)育時(shí)期的表達(dá)水平均高于TD70。由此可見(jiàn),以上7個(gè)粒型基因在2個(gè)水稻材料幼穗中具有不同的表達(dá)模式,對(duì)水稻籽粒發(fā)育調(diào)控的作用和時(shí)期亦不同。

A：識(shí)別號(hào)(ID)為Os03g0646900、Os03g0407400、Os08g0531600、Os05g0187500基因分析；B：識(shí)別號(hào)(ID)為Os02g0244100、Os07g0603300、Os05g0158500、Os11g0247300基因分析；C：識(shí)別號(hào)(ID)為Os03g0687700、Os04g0580700、Os09g0309600、Os02g0638650基因分析；D：識(shí)別號(hào)(ID)為Os06g0147500、Os12g0114800、Os01g0944200、Os03g0712800基因分析。fold change表示某個(gè)基因在2個(gè)水稻材料幼穗中的表達(dá)量。x坐標(biāo)軸上的1、2、3分別表示比較組T-P1/K-P1、T-P2/K-P2、T-P3/K-P3；T:TD70;K:Kasalath;P1、P2、P3：孕穗期1～3 cm、4～7 cm、8～10 cm長(zhǎng)度的幼穗。圖4 2個(gè)水稻材料幼穗中差異表達(dá)基因的qRT-PCR分析Fig.4 The qRT-PCR analysis of differentially expressed genes in two rice cultivars

2.6 2個(gè)水稻材料幼穗中差異表達(dá)基因的GO富集與代謝通路分析

生物體內(nèi)生物學(xué)功能的行使需要不同基因共同協(xié)調(diào)完成,為了探究差異表達(dá)基因的生物學(xué)功能,筆者對(duì)2個(gè)水稻材料3個(gè)幼穗發(fā)育時(shí)期的差異表達(dá)基因(數(shù)量分別為3 618個(gè)、4 183個(gè)、5 254個(gè))按照GO的3個(gè)類(lèi)別的生物進(jìn)程(Biological processes, BP)、細(xì)胞組分(Cellular components, CC)和分子功能(Molecular functions, MF)進(jìn)行功能富集分析。結(jié)果顯示,共有4 374個(gè)差異表達(dá)基因得到注釋?zhuān)琍1、P2和P3這3個(gè)時(shí)期分別注釋到1 825個(gè)(50.44%)、2 267個(gè)(54.20%)、2 929個(gè)(55.75%)基因。在水稻幼穗發(fā)育的P1階段,代謝進(jìn)程(GO編號(hào):0008152)、DNA結(jié)合(GO編號(hào):0005488)及細(xì)胞進(jìn)程(GO編號(hào):0005623)分別是生物學(xué)進(jìn)程、分子功能和細(xì)胞組分3個(gè)類(lèi)別中富集到最多基因的分組。差異表達(dá)基因在生物學(xué)途徑中的生物進(jìn)程調(diào)節(jié)(GO編號(hào):0050789)、信號(hào)(GO編號(hào):0023052)、生殖進(jìn)程(GO編號(hào):0022414)及發(fā)育過(guò)程(GO編號(hào):0032502)等二級(jí)分類(lèi)中較為集中。同時(shí),在生長(zhǎng)(GO編號(hào):0040007)、細(xì)胞增殖(GO編號(hào):0008283)等可能與水稻穎殼大小密切相關(guān)的代謝途徑中也有差異表達(dá)基因顯著富集。在分子功能方面,差異表達(dá)基因主要富集在催化活性(GO編號(hào):0003824)、轉(zhuǎn)運(yùn)活性(GO編號(hào):0005215)及分子功能調(diào)節(jié)(GO編號(hào):0098772)等功能類(lèi)別中。在細(xì)胞組分方面,膜系統(tǒng)(GO編號(hào):0016020)、細(xì)胞器(GO編號(hào):0043226)及蛋白質(zhì)復(fù)合體(GO編號(hào):0032991)等細(xì)胞代謝相關(guān)的重要組分的差異表達(dá)基因較多。通過(guò)以上GO富集分析發(fā)現(xiàn),在水稻幼穗發(fā)育過(guò)程中,基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、物質(zhì)的合成與運(yùn)輸以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等代謝活動(dòng)較為活躍。此外,隨著水稻幼穗的生長(zhǎng)發(fā)育,富集到的差異表達(dá)基因數(shù)量逐漸增加,說(shuō)明在幼穗發(fā)育后期,生物學(xué)進(jìn)程更加活躍、復(fù)雜,因而參與調(diào)控的基因也更多(圖5)。

利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行代謝通路分析。結(jié)果表明,在水稻的3個(gè)幼穗發(fā)育時(shí)期分別有217個(gè)、258個(gè)、332個(gè)基因得到注釋,共涉及119條KEGG代謝通路。同一個(gè)KEGG中包含10個(gè)以上差異表達(dá)基因的通路主要有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工通路、淀粉和蔗糖代謝通路、激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、氨基酸生物合成通路、碳代謝通路以及核糖體通路等,其中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工通路在水稻的3個(gè)幼穗發(fā)育階段都被顯著富集,淀粉和蔗糖代謝通路、碳代謝通路在水稻幼穗發(fā)育后期顯著富集。此外,次生代謝產(chǎn)物的生物合成通路也富集到大量基因,表明次生代謝產(chǎn)物在水稻幼穗發(fā)育過(guò)程中可能也有重要作用(表3)。

A：T-P1/K-P1差異表達(dá)基因的GO結(jié)果；B：T-P2/K-P2差異表達(dá)基因的GO結(jié)果；C：T-P3/K-P3差異表達(dá)基因的GO結(jié)果。T:TD70;K:Kasalath;P1、P2、P3：孕穗期1～3 cm、4～7 cm、8～10 cm長(zhǎng)度的幼穗。圖A中，a1:代謝進(jìn)程；a2:細(xì)胞進(jìn)程；a3:生物調(diào)節(jié)；a4:生物進(jìn)程調(diào)節(jié)；a5:刺激反應(yīng)；a6:定位；a7:細(xì)胞組分組織或生物發(fā)生；a8:信號(hào)；a9:多細(xì)胞有機(jī)體進(jìn)程；a10:發(fā)育進(jìn)程；a11:生物進(jìn)程正調(diào)節(jié)；a12:多種生物進(jìn)程；a13:生殖進(jìn)程；a14:生殖；a15:生長(zhǎng)；a16:細(xì)胞增殖；b1:DNA結(jié)合；b2:催化活性；b3:轉(zhuǎn)運(yùn)活性；b4:轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)活性；b5:結(jié)構(gòu)分子活性；b6:分子功能調(diào)節(jié)；b7:抗氧化活性；c1:細(xì)胞；c2:細(xì)胞部分；c3:膜；c4:膜部分；c5:細(xì)胞器；c6:細(xì)胞器部分；c7:蛋白質(zhì)復(fù)合體；c8:胞外區(qū)；c9:膜封閉腔。圖B中，a1:代謝進(jìn)程；a2:細(xì)胞進(jìn)程；a3:生物調(diào)節(jié)；a4:生物進(jìn)程調(diào)節(jié)；a5:刺激反應(yīng)；a6:定位；a7:細(xì)胞組分組織或生物發(fā)生；a8:信號(hào)；a9:發(fā)育進(jìn)程；a10:多細(xì)胞有機(jī)體進(jìn)程；a11:生物進(jìn)程正調(diào)節(jié)；a12:多種生物進(jìn)程；a13:生殖進(jìn)程；a14:生殖；a15:生長(zhǎng)；a16:細(xì)胞增殖；b1:DNA結(jié)合；b2:催化活性；b3:轉(zhuǎn)運(yùn)活性；b4:轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)活性；b5:分子功能調(diào)節(jié)；b6:抗氧化活性；b7:結(jié)構(gòu)分子活性; b8:分子轉(zhuǎn)運(yùn)活性；c1:細(xì)胞；c2:細(xì)胞部分；c3:膜；c4:膜部分；c5:細(xì)胞器；c6:細(xì)胞器部分；c7:蛋白質(zhì)復(fù)合體；c8:胞外區(qū)；c9:膜封閉腔；c10:細(xì)胞連接；c11:共質(zhì)體。圖C中，a1:代謝進(jìn)程；a2:細(xì)胞進(jìn)程；a3:生物調(diào)節(jié)；a4:生物進(jìn)程調(diào)節(jié)；a5:刺激反應(yīng)；a6:定位；a7:細(xì)胞組分組織或生物發(fā)生；a8:發(fā)育進(jìn)程；a9:信號(hào)；a10:多細(xì)胞有機(jī)體進(jìn)程；a11:生物進(jìn)程正調(diào)節(jié)；a12:多種生物進(jìn)程；a13:生殖；a14:生殖進(jìn)程；a15:生長(zhǎng)；a16:免疫系統(tǒng)過(guò)程；a17:細(xì)胞增殖；b1:DNA結(jié)合；b2:催化活性；b3:轉(zhuǎn)運(yùn)活性；b4:轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)活性；b5:分子功能調(diào)節(jié)；b6:結(jié)構(gòu)分子活性；b7:分子轉(zhuǎn)運(yùn)活性;b8:抗氧化活性；b9:分子轉(zhuǎn)運(yùn)活性;c1:細(xì)胞；c2:細(xì)胞部分；c3:膜；c4:膜部分；c5:細(xì)胞器；c6:細(xì)胞器部分；c7:蛋白質(zhì)復(fù)合體；c8:胞外區(qū)；c9:膜封閉腔；c10:細(xì)胞連接；c11:共質(zhì)體；c12:超分子復(fù)合物。圖5 TD70和Kasalath在水稻幼穗不同時(shí)期差異表達(dá)基因的功能分析Fig.5 Functional analysis of differentially expressed genes in TD70 and Kasalath at different stages of young panicles

2.7 2個(gè)水稻材料幼穗中差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子分析

轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)結(jié)合到靶基因啟動(dòng)子區(qū)域特定的元件上以調(diào)控基因的表達(dá),在植物生長(zhǎng)發(fā)育中起著重要作用。已克隆的粒型基因GW8基因?qū)儆赟BP轉(zhuǎn)錄因子家族,GLW7屬于SPL(Squamosa promoter binding protein-like)轉(zhuǎn)錄因子家族,LG3屬于AP2轉(zhuǎn)錄因子家族,OsMADS1為MADS-box家族轉(zhuǎn)錄因子[6,8,15,38]。由此可見(jiàn),轉(zhuǎn)錄因子在水稻幼穗發(fā)育中有重要的調(diào)控作用。通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(kù)(http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/)和NCBI的nr數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行注釋,共得到來(lái)自43個(gè)家族的349個(gè)已知或者預(yù)測(cè)的轉(zhuǎn)錄因子,如圖6所示,其中有3個(gè)ARF(生長(zhǎng)素相應(yīng)因子)家族的轉(zhuǎn)錄因子,32個(gè)bHLH(Basic helix-loop-helix)家族的轉(zhuǎn)錄因子,34個(gè)ERF(乙烯相應(yīng)因子)家族的轉(zhuǎn)錄因子,10個(gè)MADS-box家族的轉(zhuǎn)錄因子,這些差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子可能對(duì)幼穗發(fā)育具有重要的調(diào)控作用。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),與Kasalath相比，TD70中粒型基因OsLG3在P1期顯著上調(diào)表達(dá),在P2、P3期的表達(dá)量沒(méi)有顯著差異；GW8基因在幼穗中3個(gè)時(shí)期均上調(diào)表達(dá),但差異不顯著,GLW7基因的表達(dá)模式與GW8基因相反；OsMADS1基因表達(dá)量在2個(gè)材料間差異不顯著。這可能是由于TD70與Kasalath的遺傳背景差異較大,同時(shí)TD70中聚合了多個(gè)粒型基因,而不同基因在調(diào)控水平上可能存在互作等。

表3 KEGG通路中10個(gè)以上差異表達(dá)基因的代謝通路信息

圖6 2個(gè)水稻材料幼穗中差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子分析Fig.6 Analysis of differentially expressed transcription factors in two rice materials

3 討 論

水稻粒型基因的研究一直倍受重視,目前研究者已經(jīng)定位并克隆了大量粒型基因,然而水稻超大籽粒形成的分子機(jī)制尚不清晰。本研究對(duì)相同發(fā)育階段TD70、Kasalath水稻的幼穗進(jìn)行比較,在P1、P2和P3發(fā)育階段分別獲得3 618個(gè)、4 183個(gè)和5 254個(gè)差異表達(dá)基因,差異表達(dá)基因的數(shù)量隨著幼穗的發(fā)育逐漸增加,可能由于在幼穗發(fā)育后期,調(diào)控網(wǎng)絡(luò)更加復(fù)雜,參與的基因也更多。GO富集分析顯示,這些差異表達(dá)基因涉及的生物學(xué)途徑主要集中在信號(hào)(GO編號(hào):0023052)、細(xì)胞增殖(GO編號(hào):0008283)、催化活性(GO編號(hào):0003824)、轉(zhuǎn)運(yùn)活性(GO編號(hào):0005215)、膜系統(tǒng)(GO編號(hào):0016020)、蛋白質(zhì)復(fù)合體(GO編號(hào):0032991)等細(xì)胞代謝相關(guān)的重要途徑。由此可見(jiàn),孕穗期幼穗的發(fā)育涉及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞分裂、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等重要進(jìn)程,這些生物學(xué)途徑在孕穗期對(duì)水稻幼穗的發(fā)育起到至關(guān)重要的作用。以上研究結(jié)果與前人對(duì)水稻幼穗的轉(zhuǎn)錄組研究結(jié)果基本一致[31-33]。研究發(fā)現(xiàn),GS5、GW7/GL7、GW8等粒型基因通過(guò)調(diào)控水稻穎殼細(xì)胞周期的變化而調(diào)控粒型[14-16,21]。TD70超大籽粒是多個(gè)粒型基因聚合的結(jié)果,不同粒型基因涉及膜蛋白、激素以及各類(lèi)酶類(lèi)等大分子相關(guān)途徑,通過(guò)調(diào)節(jié)穎殼細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)而最終影響籽粒大小[24-26]。通過(guò)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)幼穗3個(gè)發(fā)育時(shí)期都差異表達(dá)的基因進(jìn)行代謝通路的富集分析，結(jié)果顯示,差異表達(dá)基因共涉及119條KEGG代謝通路；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工、淀粉和蔗糖代謝、碳代謝、激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多個(gè)通路代謝旺盛。細(xì)胞周期蛋白和細(xì)胞分裂素相關(guān)基因在幼穗發(fā)育的3個(gè)時(shí)期表現(xiàn)出顯著差異,推測(cè)在幼穗發(fā)育過(guò)程中2個(gè)材料穎殼細(xì)胞分裂的差異是后期二者籽粒大小差異的重要原因。通過(guò)GO和KEGG分析發(fā)現(xiàn),調(diào)控通路的差異涉及生命大分子物質(zhì)的合成與代謝、激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及膜系統(tǒng)等,可以為水稻幼穗細(xì)胞分裂、生長(zhǎng)與分化等生命過(guò)程提供重要的物質(zhì)基礎(chǔ)、能量來(lái)源以及重要的分子信號(hào)等。

轉(zhuǎn)錄因子作為重要的調(diào)節(jié)蛋白,在水稻穗發(fā)育和籽粒形成過(guò)程中起著重要作用[39]。本研究發(fā)現(xiàn),在2個(gè)水稻材料幼穗中349個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量存在顯著差異,其中包括AP2、ARF、bHLH、MYB、MADS等家族的轉(zhuǎn)錄因子。在多個(gè)物種中的功能鑒定結(jié)果表明,植物中MYB轉(zhuǎn)錄因子家族具有調(diào)節(jié)植物發(fā)育、開(kāi)花時(shí)間等不同的功能[40]。MADS轉(zhuǎn)錄因子家族在植物生殖器官發(fā)育中起到重要的調(diào)節(jié)作用,OsMADS1基因與水稻G蛋白互作對(duì)籽粒大小具有調(diào)控作用[8]。綜上可見(jiàn),轉(zhuǎn)錄因子對(duì)水稻孕穗期幼穗的發(fā)育和籽粒形態(tài)有重要的調(diào)控作用。

本研究通過(guò)對(duì)不同大小的水稻幼穗進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組深度測(cè)序,系統(tǒng)地揭示了特大粒水稻TD70幼穗發(fā)育在不同時(shí)期表達(dá)譜的變化,為進(jìn)一步研究水稻籽粒發(fā)育過(guò)程中基因互作網(wǎng)絡(luò)以及粒型基因在分子育種中的有效利用提供了理論依據(jù)。