高效液相色譜法串聯質譜法測定禽蛋中恩諾沙星殘留量的不確定度評定

王華 劉冬靈 金其揚 蒙麗瓊

摘 要：目的：評定高效液相色譜法串聯質譜法檢測禽蛋中恩諾沙星殘留量的不確定度及擴展不確定度。結果：當禽蛋中恩諾沙星含量為6.63μg/kg時，在95%的置信區間下，擴展不確定度為1.2μg/kg（k=2）。結論：實驗過程的不確定度主要來源于標準曲線擬合過程和標準溶液配制所產生的不確定度，其次為重復測量和回收率的不確定度。

關鍵詞：高效液相色譜法串聯質譜法;禽蛋;恩諾沙星;不確定度

恩諾沙星是第三代喹諾酮藥物的一種，是合成抗菌藥物，其毒性主要取決于藥劑量和動物種類[1-2]。研究證明恩諾沙星在實驗動物中顯示一定的致突變和胚胎毒性作用[3]。喹諾酮類藥物廣泛用于獸醫臨床，已經出現了細菌耐藥性，并且在動物源性食品中的喹諾酮殘留量容易誘導人類致病菌產生耐藥性[4-5]。我國、歐盟、美國、日本等都制定了喹諾酮在各動物組織中最大允許殘留限量[6-9]。美國FDA于2005年禁止恩諾沙星作為飼料添加劑用于禽類[10]。我國規定家禽產蛋期禁用恩諾沙星[11]。禽蛋中恩諾沙星的檢測方法有液相色譜法、液質法、酶聯免疫吸附法[12-15]。測量不確定度表征賦予了被值的分散性，是測量結果的一部分，是符合性判斷需要考慮的主要內容之一[16-17]。禽蛋中恩諾沙星的不確定度評定具有非常重要的意義，目前鮮少有報道禽蛋中恩諾沙星殘留量的測定的不確定度評定。本文基于GB/T 21312-2007進行禽蛋中恩諾沙星殘留量檢測的不確定度評定。

1 材料和方法

1.1 試劑與耗材

正己烷、乙睛、甲酸（AR），甲酸、甲醇（色譜純），14種喹諾酮標準溶液（ANPEL）。

1.2 儀器和設備

安捷倫6410B列安捷倫液相--質譜色譜儀（ESI源）;分析天平：十萬分之一天平（賽多利斯ecura225D-1CN），檢定允許誤差為±0.0001g;電子天平：JJ1000/0.01g～1000g，允差±0.05g;旋渦混合器;離心機;旋轉蒸發儀。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

按照稱取2.00g禽蛋試樣按照GB/T 21311-2007進行樣品處理，用2.00mL甲酸--乙睛溶液定容。

1.3.2 色譜條件

XDB-C18色譜柱（4.6×50mm，1.8μm）;柱溫35℃;進樣量2μL;流動相A為乙腈，流動相B為0.1%甲酸水;流動相洗脫程序：0-1min，80%B;1-7min，80%B線性變至50%B;7-8min，50%B-80%。

1.3.3 質譜條件

離子源：ESI（+）;掃描模式：MRM;干燥氣：350℃，45psi，10L/min;毛細管電壓：4000V。定量離子對360/342.2，定性離子對360/316.2。

2 結果和分析

2.1 不確定度的來源分析

根據分析步驟，不確定度的主要來源主要有：①樣品質量稱量（m）;②定容體積（V）;③被測物質量濃度（C）;④測量重復性;⑤回收率。

2.2 不確定度的評定

2.2.1 樣品稱量的不確定度u（m）

稱取2g樣品，所用天平最大允許誤差為±0.01g，按照矩形分布計算，其標準不確定度和相對標準不確定度分別為：

2.2.2 定容體積產生的不確定度u（v）

樣品最后用2mL分度吸量管取V為2mL水溶解蒸殘物。

2.2.3 被測物的質量濃度產生的不確定度u（C）

C的不確定度來源有標準系列溶液配制和標準曲線擬合。其中標準系列溶液配制又分為儲備液的稀釋、標準曲線溶液的配制。

2.2.3.1 標準溶液稀釋產生的不確定度u（C-1）

根據標準證書，恩諾沙星標準品的純度誤差為±5%，按照均勻分布計算，由純度引入的不確定度和相對不確定度分別為：

用1mL單標線吸量管移取儲備液1mL于10mL容量瓶（A級）中，用乙腈定容至刻度，得到質量濃度為10μg/mL的標準溶液（1：10稀釋）。按照均勻分布處理，玻璃器具及溫度波動引入的不確定度見表1。

2.2.3.2 標準曲線配制過程產生的不確定度u（C-2）

使用20、100、200μL移液器分別移取一定的標準溶液于1mL容量瓶中，用空白禽蛋基質溶液定容至刻度，得到質量濃度分別為1、2、5、10、20、50μg/L的標準系列工作溶液，移液器的刻度誤差參考JJG 646-2006《移液器檢定規程》的要求，按A類評定，如表2所示。

2.2.3.3 標準工作曲線擬合產生的不確定度u（C-3）

將空白禽蛋基質溶液配制的5種不同質量濃度的標準系列溶液，各取5μL分別重復進樣3次，以峰面積（Ai）為縱坐標，標準溶液濃度（Ci）為橫坐標，采用最小二乘法擬合而成的線性回歸方程為Ai=aCi+b，測定數據及計算結果如表3。取一陽性樣品，對各待測化合物濃度C0進行3次重復測定，平均結果為14.7μg/L，則由標準曲線擬合產生的不確定度按（1）式計算：

式中：SR為標準溶液待測物峰面積殘差的標準差;a為斜率;b為截距;p為對樣品溶液C0的測定次數，p=3;n為標準溶液測試次數，本實驗中5個質量濃度重復測定3次，n=5×3=15;Ai為標準溶液各點的待測物的峰面積;Ci為標準溶液各點的待測物的質量濃度;C0為校準方程求得的陽性樣品溶液中待測物的質量濃度;為標準溶液的平均質量濃度，;則相對標準不確定度u（C-4）=u（C4）/C0，結果見表4。

3 結論

實驗過程中，稱量、提取、凈化測定等過程均會引入不確定度，本實驗通過對質量、體積、實驗室溫度、玻璃儀器、溶液配制、稀釋、重復測定、回收率等因素研究，通過計算，發現標準曲線擬合過程和標準溶液配制所產生的不確定度最大，其次為回收率、測量重復性和體積量取引入的不確定度影響。因此，在實驗過程中，認真配制標準曲線，增加平行樣品測定，提高實驗人員檢測的精密性和準確度水平，可達到減小測量不確定度，從而提高檢測結果的準確性。

參考文獻：

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[15]農業部1025號公告-8-2008.動物性食品中氟喹諾酮類藥物殘留檢測 酶聯免疫吸附法[Z].

[16] RB/T141-2018.化學檢測領域測量不確定度評定 利用質量控制和方法確認數據評定不確定度[S].北京：中國國家認證認可監督管理委員會，2018.

[17] CNAS-TRL-010-2019 CNAS-TRL-010-2019.測量不確定度在符合性判定中的應用[Z].

通訊作者：

蒙麗瓊，高級工程師，主要研究方向為食品質量安全。

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