基于RNA Seq技術分析江西豆豉對腸上皮細胞基因差異表達的影響

譚強來 曾臻 武曉麗 徐鋒

摘 要：目的：基于RNA?Seq研究江西傳統(tǒng)特色豆豉與腸上皮細胞的相互作用。方法：Caco?2細胞與豆豉水提樣共孵育后，采用RNA?Seq篩選差異表達基因，進行KEGG、GO和PPI網(wǎng)絡分析。結果：篩選差異表達基因17 892個，其中顯著性240個，含上調(diào)表達125個、下調(diào)表達115個。KEGG功能注釋215個信號通路，主要富集在新陳代謝、免疫系統(tǒng)、細胞調(diào)控、細胞粘附等類別。GO分析主要涉及免疫應答、細胞結構及功能調(diào)控、營養(yǎng)素代謝、神經(jīng)傳導及激素分泌調(diào)節(jié)等生物學過程。PPI網(wǎng)絡分析在STRING數(shù)據(jù)庫內(nèi)有效注釋的204個基因編碼的蛋白互作，其中IL8、VCL、NFKBIA等節(jié)點度較高。結論：江西傳統(tǒng)特色豆豉可引起腸上皮細胞多類基因差異表達，為闡明豆豉對腸道健康作用的分子機制提供科學依據(jù)。

關鍵詞：豆豉;腸上皮細胞;RNA?Seq;基因差異表達

研究表明，豆豉微生物發(fā)酵過程中可生成纖溶酶、異黃酮甙元、α?葡萄糖苷酶抑制劑等各種活性成分，從而發(fā)揮降血脂、降血糖、維持腸道菌群平衡、調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、保護早期動脈粥樣硬化血管內(nèi)皮損傷等保健功能[1]。目前研究主要集中在微生物組成或功效組分的活性篩選鑒定[2?4]，采用轉錄組學技術從分子水平探究豆豉與腸道相互作用機制尚未報道。RNA?Seq結合了轉錄組建庫方法與數(shù)字基因表達譜信息分析手段，相比傳統(tǒng)基因芯片，具有可檢測低豐度基因，定量準、重復性好等優(yōu)點[5]，適用于全面的差異基因表達及功能聚類分析，探尋生物學功能及分子作用機制，近年來漸成轉錄組學研究的主流工具。徐柳柳等[6]采用RNA?Seq篩選禽致病性大腸桿菌感染的雛雞腸道免疫相關基因。本研究采用RNA?Seq分析江西傳統(tǒng)特色豆豉作用后腸上皮細胞的基因表達差異，經(jīng)KEGG富集、GO功能和PPI網(wǎng)絡分析，以期從分子水平上識別其功能、參與的代謝通路和相互作用途徑，為闡明豆豉對腸道健康作用的分子機制提供科學依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?材料

豆豉，由南昌稻香園調(diào)味食品有限公司提供，參照文獻[7]制備豆豉水提物并作適當調(diào)整，簡述如下：無菌條件下稱取磨碎過篩的豆豉，按豆豉（W）：無菌PBS（V）=1∶9充分混勻，于4℃下振蕩浸提過夜后，經(jīng)?1 000 r/min離心10 min及無菌濾膜過濾除去顆粒殘渣，收集上清液，冷凍干燥后即得。人結腸癌Caco?2細胞，為本實驗室液氮凍存，經(jīng)復蘇后，置含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基的25 mm2細胞培養(yǎng)瓶，于5% CO2細胞培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)至融合率80%～90%;如需傳代，用0.25%胰酶?EDTA消化、離心、重懸至新瓶。

1.2?方法

1.2.1?實驗樣品組處理?收集對數(shù)生長期Caco?2細胞，調(diào)整細胞密度約為1×105個/mL，轉移至24孔板培養(yǎng)約24 h至完整單細胞層形成，移除培養(yǎng)上清，以450 μL/孔加入新鮮細胞培養(yǎng)液，再將50 μL已制備好的豆豉樣品加入，于5% CO2細胞培養(yǎng)箱37℃共孵育?2 h，設6個復孔，為樣品處理組;另設加等量不含豆豉樣品的無菌PBS共孵育的Caco?2細胞孔為陰性對照組。

1.2.2?RNA?Seq實驗?由深圳華大基因科技服務有限公司完成。實驗步驟簡述如下：用TRNzol法分別提取兩組細胞總RNA，加DNaseI消化雜質(zhì)DNA去除干擾;用帶Oligo（dT）的磁珠富集mRNA;加入適量打斷試劑，高溫條件下得到片斷化的mRNA;再以此模板合成cDNA;經(jīng)磁珠純化、末端修復、3’末端加A堿基、加測序接頭后PCR擴增，構建文庫;經(jīng)檢測質(zhì)控合格后Illumina HiSeq?TM 2000測序。

1.2.3?數(shù)據(jù)處理與分析?測序原始數(shù)據(jù)（raw reads）經(jīng)濾除低質(zhì)量、重復、接頭等序列后得過濾后數(shù)據(jù)（clean reads），根據(jù)基因的表達量（FPKM值）和錯誤發(fā)生率（FDR）多重檢驗校正P值，分析兩組樣品間的共有和特異表達基因，并以“FDR≤0.001且倍數(shù)差異在2倍以上”為標準界定顯著差異表達基因。對樣品間差異表達基因進行KEGG富集分析，以確定差異表達基因最主要參與的生化代謝途徑和信號轉導途徑，從而進一步了解其生物學功能;進行GO功能（涵蓋分子功能、生物過程、細胞組分等三類）分析，以對差異表達基因的功能進行預測、鑒定和驗證;采用STRING 10.5在線數(shù)據(jù)庫（https：//string?db.org/）進行蛋白互作網(wǎng)絡分析，以對顯著差異表達基因（蛋白）間相互作用進行功能關聯(lián)。

2?結果與分析

2.1?測序質(zhì)量評估

陰性對照組、豆豉樣品處理組RNA轉錄組測序clean reads分別獲得22 250 879、22 216 538條，分別占raw reads的99.55%、99.4%，表明測序質(zhì)量比較好。

2.2?比對分析

將陰性對照組、豆豉樣品處理組的clean reads使用Bowtie軟件比對到參考基因，基因覆蓋率分別占72.83%、73.82%;利用BWA軟件比對到參考基因組，基因組覆蓋率分別達86.82%、89.02%;可注釋的表達基因分別為16 729、17 127個，表明測序覆蓋率較高、整體質(zhì)量較好。

2.3?差異表達基因篩選

根據(jù)基因的表達量（FPKM值）分析兩組樣品間的共有和特異表達基因（合計17 892個）繪制成散點圖（圖1）。與陰性對照組相比，除去共有表達基因15 964個，豆豉樣品處理組另有特異表達基因共1 928個，其中上調(diào)表達765個、下調(diào)表達1 163個。在此基礎上，基于泊松分布的分析方法，以“FDR≤0.001且倍數(shù)差異在2倍以上”為標準，篩選顯著差異表達基因，共篩選出顯著差異表達基因240個，其中上調(diào)表達125個、下調(diào)表達115個。

2.4?差異表達基因KEGG富集分析

豆豉樣品處理組與陰性對照組相比，其引起Caco?2細胞差異表達基因共得到215個信號通路條目的功能注釋。將富集程度排名前20的信號通路條目以圖形化方式展示（圖2），其中包括細胞間粘附連接相關的ko04520：Adherens junction和與細胞調(diào)控相關的ko04012：ErbB signaling pathway，表明豆豉樣品處理或顯著地影響腸上皮細胞結構和功能完整性。因此，為更全面且有針對性地綜合分析其生物學效應，將各信號通路根據(jù)所注釋的功能歸類去冗，主要富集在新陳代謝（65個）、免疫系統(tǒng)（16個）、細胞調(diào)控（10個）、神經(jīng)系統(tǒng)（9個）、細胞粘附（7個）和胰島素—糖尿病（4個）等類別。

篩選各類部分典型信號通路，對涉及的差異表達基因組成進行分析（表1），其中40個顯著差異表達基因以下劃線標示。在免疫系統(tǒng)相關信號通路中，大量差異表達基因富集在“ko04060：Cytokine?cytokine receptor interaction”“ko04670：Leukocyte transendothelial migration”“ko04660：T cell receptor signaling pathway”等中。在細胞粘附相關信號通路中，差異表達基因主要集中在“ko04810：Regulation of actin cytoskeleton”“ko04510：Focal adhesion”“ko04530：Tight junction”“ko04520：Adherens junction”等中。同時，“ko04010 MAPK signaling pathway”“ko04012 ErbB signaling pathway”“ko04630 Jak?STAT signaling pathway”等多個差異表達基因的信號通路參與細胞增殖、分化、遷移、存活等調(diào)控途徑。而且，功能歸類結果還顯示與神經(jīng)系統(tǒng)相關如“ko04360：Axon guidance”“ko04726 Serotonergic synapse”等，以及與胰島素?糖尿病相關如“ko04910：Insulin signaling pathway”“ko04920：Adipocytokine signaling pathway”“ko04930：Type II diabetes mellitus”等兩類信號通路。此外，歸類時還發(fā)現(xiàn)存在多個與食源性致病菌相關的信號通路，如“ko05132：Salmonella infection”“ko05130：Pathogenic Escherichia coli infection”“ko05100：Bacterial invasion of epithelial cells”“ko05150：Staphylococcus aureus infection”等。

2.5?差異表達基因GO功能分析

豆豉樣品處理組中240個顯著差異表達基因的GO功能分析，主要包括免疫應答、細胞結構及功能調(diào)控、營養(yǎng)素代謝、神經(jīng)傳導及激素分泌調(diào)節(jié)等。結合表1中KEGG富集篩選出的各類典型信號通路的差異表達基因組成，選取其中最具有代表性的10個顯著差異表達基因GO功能分析（表2）。其中，IL8、NFKBIA、ITGA6、F3、WNT5A均與免疫系統(tǒng)調(diào)控密切相關，VCL、FERMT2等參與了細胞骨架及細胞間粘附過程，PRKAR1A、PTPN11主要與胰島素的分泌與調(diào)節(jié)相關，ACSL3則顯示與脂質(zhì)代謝有關。

2.6?差異表達基因（蛋白）相互作用

豆豉樣品處理組中240個顯著差異表達基因，經(jīng)STRING10.5在線數(shù)據(jù)庫篩查獲得204個有效注釋的基因（蛋白）數(shù)據(jù)，構建蛋白互作網(wǎng)絡圖。結果表明，IL8、VCL、NFKBIA等基因（蛋白）的節(jié)點度較高，與其他顯著差異表達基因（蛋白）存在較多、較復雜的相互作用。

3?討論

豆豉作為一種風味獨特、營養(yǎng)豐富的傳統(tǒng)發(fā)酵食品，從古至今向來都是餐桌上的常客。近年來，其優(yōu)越的保健功能被廣大科研工作者尤為關注。如馮薇等[8]發(fā)現(xiàn)，淡豆豉提取物成分具有促成骨細胞增殖活性。然而，過往對豆豉的研究還多著眼于其微生物群落多樣性或組分活性評估[3?4，9?11]，對其攝入體內(nèi)后與腸道的相互作用及其分子機制的研究尚屬空白。前人已成功將RNA?Seq技術應用于氧化魚油影響草魚腸道代謝通路的分子作用機制研究[12]。因此，本研究對與豆豉共孵育后腸上皮細胞進行RNA?Seq篩查，分析差異表達基因的KEGG通路、GO功能和PPI途徑，探索豆豉對腸道結構、功能和健康的分子作用機制。

RNA?Seq結果顯示，與豆豉共孵育后，Caco?2腸上皮細胞的基因表達水平發(fā)生明顯的變化，其中240個基因發(fā)生顯著差異表達（圖1），表明二者間存在密切的互作機制。對差異表達基因參與的生化代謝和信號轉導途徑進行KEGG富集分析，主要集中在免疫應答、細胞粘附、細胞調(diào)控、新陳代謝相關等信號通路，表明豆豉作用于腸上皮細胞，對腸道正常生理功能和完整屏障結構的形成和發(fā)展存在廣泛的影響。Woo等[13]發(fā)現(xiàn)，大麥和大豆混合發(fā)酵物能夠減輕葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）誘導結腸炎小鼠的炎癥程度，抑制促炎細胞因子的水平，降低腸道通透性，提高緊密連接蛋白水平，恢復腸上皮細胞屏障功能[13]。Lee等[14]動物實驗結果證實，攝食大豆發(fā)酵制品可同時增強體液免疫和細胞免疫功能。此外，大量研究表明，豆豉中富含的乳酸菌等可促進宿主腸道健康[3，15]。本研究還發(fā)現(xiàn)，如“Insulin signaling pathway”“Adipocytokine signaling pathway”“Type II diabetes mellitus”“Type I diabetes mellitus”等與胰島素—糖尿病相關信號通路，或表明豆豉中組成益生菌及其益生代謝組分或通過調(diào)節(jié)胰島素分泌及受體敏感度等方式改善肥胖和糖尿病。不少研究表明，豆豉或其提取物通過抑制α?葡萄糖苷酶活性、改善糖代謝和/或提高胰島素敏感性等機制發(fā)揮降血糖功效[16?18]。課題組前期汪孟娟等[2]發(fā)現(xiàn)，豆豉水提物可較好地抑制α?葡萄糖苷酶活性，董素琴[1]則從豆豉中分離、鑒定出一株能顯著降血糖的解淀粉芽孢桿菌，均證實稻香園豆豉具有防治2型糖尿病的潛力，與本研究結果一致。同時結果還顯示，多個差異表達基因富集在神經(jīng)系統(tǒng)相關信號通路，推測豆豉中微生物及其組分或以腦腸軸的形式作用于腸和中樞神經(jīng)系統(tǒng)[19?20]。此外，差異表達基因歸類時，存在多個與食源性致病菌相關的信號通路，包括“Salmonella infection”“Pathogenic Escherichia coli infection”“Bacterial invasion of epithelial cells”“ko05150：Staphylococcus aureus infection”等，或源于豆豉為自然條件下傳統(tǒng)發(fā)酵，與環(huán)境、人員廣泛接觸，使得其微生物群落多樣性復雜有關。如課題組前期研究均發(fā)現(xiàn)，葡萄球菌屬、腸桿菌屬廣泛存在于稻香園豆豉中[3?4，9]。李曉然等[21]在豆豉細菌群落多樣性進行高通量測序分析時，發(fā)現(xiàn)了福氏志賀氏菌（Shigella flexneri）序列。對顯著差異表達基因進行GO功能分析，主要涉及免疫應答、細胞結構及功能調(diào)控、代謝及分泌調(diào)節(jié)等生物學過程。進一步構建蛋白互作網(wǎng)絡圖，結果表明，免疫相關的IL8[22]、NFKBIA[23]、細胞粘附相關的VCL[24]等幾個基因（蛋白）互作參與程度較高。如Yakabe等[22]研究認為，IL?8分泌量增加有助于腸上皮細胞修復損傷及應對感染，而RNA?Seq分析顯示，IL8在豆豉與腸上皮細胞共孵育組中表達水平顯著上調(diào)。

綜上所述，本研究利用RNA?Seq繪制了腸上皮細胞受豆豉作用的基因差異表達譜，主要涉及免疫應答、細胞粘附、胰島素分泌、營養(yǎng)素代謝、細胞結構及功能調(diào)控、乃至與食源性致病菌相關的等多類別的基因功能和信號通路，為闡明豆豉攝食對腸道結構、功能和健康的分子作用機制提供科學依據(jù)。◇

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Differentially Expressed Genes of Intestinal Epithelial Cells Interacted with Jiangxi Douchi Based on RNA?Seq

TAN Qiang?lai?1，2，ZENG Zhen?1，2，WU Xiao?li3，XU Feng4

（1Engineering Research Center of Natural Cosmeceuticals of Fujian Province，Xiamen Medical College，Xiamen 361023，China;2Engineering Research Center of Marine Biopharmaceutical Resource of Fujian Province，Xiamen Medical College，Xiamen 361023，China;3School of Basic Medical Science，Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanchang 330004，China;4Jiangxi?OAI Joint Research Institute，Nanchang University，Nanchang 330047，China）

Abstract：?Objective To investigate the differentially expressed genes（DEGs）of intestinal epithelial cells interacted with Douchi based on RNA?Seq. Method After co?incubation with water?extract Douchi sample，the changes of DEGs of Caco?2 cells were surveyed using RNA?Seq.The KEGG，GO，and PPI network analysis were investigated accordingly. Result A total of 17 892 DEGs，with 240 significantly DEGs（including 125 upand 115 down?regulated expression）were obtained.KEGG results showed that 215 signaling pathways were annotated，which were involved in metabolism，immune system，cell regulation，cell adhesion，etc.GO results showed that the DEGs were mainly related to various biological processes of immune response，cell structure and function，nutrient metabolism，nerve conduction and hormone secretion.PPI network results showed that 204 DEGs were enrolled into STRING online database and interacted with each other.Furthermore，IL8，VCL，NFKBIA were considered to be hub genes with higher node degrees. Conclusion Jiangxi Douchi may cause multiple genes of intestinal cells differently expressed，which provides a basis to elucidate the molecular mechanism of Douchi and intestinal tract interaction.

Keywords：douchi;intestinal epithelial cell;RNA?Seq;differentially expressed genes