降膽固醇益生菌發酵劑的制備

李大鵬

摘?要：以前期篩選出來的降膽固醇益生菌嗜酸乳桿菌S?59為出發菌株，對凍干發酵劑的制備工藝進行研究和優化。結果表明：菌懸液的離心收集條件為5 000 r/min、20 min;通過單因素試驗和響應面優化試驗，確定凍干保護劑為脫脂乳8.95%、海藻糖5.24%、甘油4.54%，細胞存活率可達90.1%。凍干發酵劑的保藏條件為在真空條件下-4℃保藏。

關鍵詞：降膽固醇益生菌;真空冷凍干燥;離心;保護劑;保藏

目前，具有降膽固醇功能的益生菌的研究及功能性食品的開發主要集中在具有降膽固醇功能的益生菌的篩選、鑒定及體內和體外降膽固醇機理的研究[1?3]，但目前對具有降膽固醇功能的益生菌發酵劑的制備工藝鮮有研究。在發酵乳制品中已廣泛使用經離心、冷凍、干燥制備的乳酸菌發酵劑，這種發酵劑易于保證復配菌種的比例，可防止菌種失活，可減少雜菌污染和省去菌種擴培過程[4]。目前，此類產品在我國及歐美等發達國家己得到廣泛研究和應用[5]。但未見具有降膽固醇等特殊功能益生菌發酵劑的生產。本研究以前期篩選具有降膽固醇功能的益生菌嗜酸乳桿菌S?59[6]為出發菌株，分析凍干菌劑制備過程中的離心條件、凍干保護劑的種類對菌劑性能的影響，并研究制備的凍干菌劑的保存特性，為降膽固醇功能益生菌發酵食品的開發提供科學依據。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?菌懸液?嗜酸乳桿菌S?59懸浮液，在優化的培養基中和優化的條件下制備。

1.1.2?主要試劑?脫脂乳，完達山牌，市售。甘油、海藻糖，北京奧博星生物技術有限責任公司。

1.2?方法

1.2.1?菌懸液離心條件的選擇?將嗜酸乳桿菌S?59在100 mL三角瓶中裝入優化的液體培養基中，在最適的培養條件下進行培養后，將培養液移入滅過菌的離心管中，分別在4℃、不同離心條件（轉速、時間）下收獲菌體，經無菌生理鹽水洗滌2遍后用于活細胞計數[7]。

1.2.2?凍干保護劑的確定

（1）凍干保護劑的單因素試驗：將培養、離心后制備的嗜酸乳桿菌S?59的菌泥，測定活菌數N0，按照保護劑∶菌泥為（w/v）2∶1進行配比，充分混勻后，分裝至凍干瓶中，-40℃預凍6 h，在冷阱溫度-51℃，真空度0.09 MPa下冷凍22～24 h。

分別將脫脂乳配成2%、4%、6%、8%、10%、12%的濃度，將海藻糖配成1%、2%、3%、4%、5%的濃度，將甘油配成1%、2%、3%、4%、5%的濃度，以蒸餾水為空白對照，凍干后將凍干瓶在?20℃保藏48 h后，取出在30℃水浴中解凍后，測定活菌數N1，計算存活率[8]。

（2）凍干保護劑的響應面法優化：根據單因素試驗結果設計三因素三水平的響應面優化試驗。

1.2.3?凍干發酵劑保存性測定?將真空冷凍干燥后的發酵劑裝入無菌的鋁箔聚酯復合袋內在真空和常壓包裝，分別在-4℃和室溫下保藏2個月和4個月，進行活菌計數。

2?結果與分析

2.1?離心條件的確定

由表1可以看出，當離心轉速較低時，4 000 r/min時，細胞收集過程中有些小細胞不易被收集，但當離心轉速較高時，6 000 r/min時，容易導致細胞的死亡，使活細胞數較低，因此，較適宜的離心收集條件為5 000 r/min、20 min。

2.2?凍干保護劑的確定

2.2.1?凍干保護劑的單因素試驗

（1）脫脂乳對凍干菌劑細胞存活率的影響：脫脂乳的成分主要是蛋白質和糖類，其水溶液是膠體溶液，其中蛋白質的直徑較小，細菌顆粒處于蛋白質分子的包圍之中，可阻止細胞內大的冰晶的形成，有助于保持細菌活性[9]。由圖1可以看出，當脫脂乳濃度小于8%時，隨

著脫脂乳濃度的增加，細胞存活率顯著增大，當脫脂乳濃度大于8%時，隨著脫脂乳濃度的增加，細胞存活率不再顯著增加，因此，通過單因素確定的脫脂乳適宜濃度為8%。

（2）海藻糖對凍干菌劑活菌數的影響：海藻糖是一種非還原性雙糖，在蛋白質凍干過程中，海藻糖會

填補到因為蛋白質失水而產生的空缺當中，從而有效地防止微生物及蛋白質在凍干過程中發生的蛋白質的變性[10]。由圖2可以看出，海藻糖濃度對細胞存活率影響顯著，隨著海藻糖濃度的增加細胞存活率逐漸提高，但當海藻糖濃度增加到4%時，隨著海藻糖濃度的增加，細胞存活率的提高不顯著，因此，通過單因素試驗確定海藻糖適宜濃度為4%。

（3）甘油對凍干菌劑活菌數的影響：甘油，既能透過微生物的細胞壁又能透過細胞膜，在凍干的過程中能通過水合作用使溶液的粘性增加，減弱水的結晶過程，從而起到保護細胞的作用[11]。由圖3可以看出，甘油濃度對細胞存活率影響顯著，隨著甘油濃度的增加，細胞存活率逐漸提高，但當甘油濃度增加到3%時，隨著甘油濃度的增加，細胞存活率的提高不顯著，因此，通過單因素試驗確定甘油適宜濃度為3%。

2.2.2?凍干保護劑的響應面優化試驗

（1）響應面試驗設計及結果：以單因素確定的脫脂乳8%、海藻糖4%、甘油3%為中心點，進行三因素三水平的響應面優化試驗（表2、表3）。

（2）回歸分析：由SAS軟件進行脊嶺分析，得到保護劑聯合使用最大細胞理論存活率為89.554%，最佳保護劑配方為脫脂乳8.95%、海藻糖5.24%、甘油4.54%。以最佳保護劑進行3次冷凍干燥試驗，得到平均細胞存活率為90.1%。

2.2.3?凍干發酵劑保存性測定?將凍干后的發酵劑，分別在真空和常壓下包裝，分別在-4℃和室溫下保藏2個月和4個月，進行活菌計數。由表4可以看出，相同的保藏溫度下，真空保藏后發酵劑中的活菌數高于常壓保藏，在相同的真空度下，-4℃的低溫保藏后發酵劑中的活菌數高于室溫下保藏，因此，確定制備的凍干發酵劑在真空條件下-4℃保藏。

3?結論

（1）通過離心轉速和時間對細胞存活率的影響，確定離心收集條件為5 000 r/min、20 min。（2）通過單因素試驗和響應面優化試驗，確定凍干保護劑為脫脂乳8.95%、海藻糖5.24%、甘油4.54%，凍干過程中細胞存活率可達90.1%。（3）通過對制備的凍干保護劑保藏條件對細胞活菌數的影響，確定了制備的凍干發酵劑的保藏條件為在真空條件下-4℃保藏。

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Preparation of Fermentation Starter of Probiotics with Cholesterol Lowering Ability

LI Da?peng

（School of Chemistry and Material Engineering，Chaohu University，Hefei 238000，China）

Abstract：Using the probiotics Lactobacillus acidophilus S?59 with cholesterol lowering ability selected in the early as starting strain，the preparation process of the freeze drying fermentation starter was studied and optimized.Results showed that the centrifugal collection conditions of bacterial suspension was 5 000 r/min，20 min.By single factor experiment and response surface optimizing method of strain protective agent in vacuum freeze drying，the optimum protective agent of skimmed milk 8.95%，trehalose 5.24% and glycerin 4.54% was determined.And at these conditions，the cell living rate was reached to 90.1%.The condition store was at -4℃ under the condition of vacuum.

Keywords：probiotics with cholesterol lowering ability;vacuum freeze drying;centrifugal;protective agent;store