不同培養條件下杏鮑菇對硒的耐受性與硒形態分析

杜芳 鄒亞杰 張海軍 胡清秀

摘 要：為了明確不同培養條件下杏鮑菇對外源硒的耐受性，分別在固體培養基、液體發酵培養基和栽培基質中添加不同量的亞硒酸鈉，并檢測杏鮑菇子實體中富集硒的存在形態。結果表明：固體培養條件下，硒濃度低于160 mg/L時，對菌絲的生長沒有顯著影響;液體培養條件下，4 mg/L的硒元素即可對杏鮑菇菌絲體的生長產生顯著抑制;栽培模式下，基質中補充10～600 mg/kg的硒元素，不會影響杏鮑菇菌絲體的生長，且子實體中的硒含量會隨基質中硒濃度的增加而增加。子實體硒形態分析表明，富集硒以硒代蛋氨酸、甲基硒代半胱氨酸、硒代胱氨酸和亞硒酸鹽[Se（IV）]四種形式存在，其中硒代蛋氨酸是硒與氨基酸的主要結合形式。

關鍵詞：杏鮑菇;硒耐受力;硒形態;硒代氨基酸

硒是人與動物正常生理活動所必需的一種重要微量元素，在體內參與谷胱甘肽過氧化物酶、硫氧還蛋白還原酶以及碘化甲腺原氨酸脫碘酶等多種蛋白組和酶的合成，在抗突變、防衰老、抗癌、增強機體免疫力等方面發揮重要生物學功能[1-2]。1988年，中國營養學會將硒列為15種每日膳食營養元素之一，每人每日必需攝入50～250 μg的硒。我國是一個嚴重缺硒的國家，有72%的地區缺硒、30%的地區嚴重缺硒，人體硒攝入不足會引起大骨節病及克山病等一系列病癥的發生[3]。自然界中的硒元素以無機硒和有機硒兩種形態存在，無機硒一般指從金屬礦藏的副產品中獲得的亞硒酸鈉和硒酸鈉;有機硒一般以硒蛋白（功能蛋白及酶類）、硒多糖、硒核酸等形式存在[4]。毒理實驗表明，無機硒酸鹽對人體毒性大，要滿足人體對硒元素的需求，需要將無機硒轉化為更易被人體吸收且安全性更高的有機硒[5]。食用菌是良好的硒生物轉化載體，能夠將環境中的無機硒轉化為低毒、高效的有機硒，且自身含有豐富的蛋白質和多種營養元素，是開發富硒產品的研究熱點[6]。杏鮑菇菇質脆嫩，風味獨特，營養豐富，是已實現工廠化栽培的一種大型真菌。根據中國食用菌協會統計，2017年杏鮑菇總產量已達159.7萬t，產品遍及各大小超市、菜市場，是飯桌上常見的食用菌品種。杏鮑菇生產周期快、市場需求量大使之成為開發食用菌富硒制品的優選品種。研究表明，杏鮑菇菌絲體和子實體具有良好的富集、吸收和轉化硒的能力[7-8]，因此，杏鮑菇可作為一種硒補充的重要來源。雖然前人對杏鮑菇的富硒能力進行了研究，但尚未系統地研究杏鮑菇對硒的耐受性，硒濃度過高會對杏鮑菇的生長發育產生毒害作用。本研究將對液體發酵、PDA平板培養、栽培條件下杏鮑菇菌絲體對硒的耐受狀況進行比較，并對杏鮑菇子實體中富集硒的含量和形態進行全面分析，為富硒杏鮑菇產品開發提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種 杏鮑菇ACCC52611，由農業農村部微生物菌種保藏中心提供。

1.1.2 培養基 平板基本培養基配方（g/L）：土豆（去皮）200 g、葡萄糖20 g、瓊脂18 g，pH 7.33（滅菌前）。液體基本培養基配方（g/L）：土豆（去皮）200 g、葡萄糖20 g，pH 7.33（滅菌前）。栽培基質基本配方：木屑21%、甘蔗渣21%、麥麩18.4%、玉米芯18.4%、豆粕8.4%、玉米粉6.6%、棉籽殼4.2%、石灰1%、石膏1%。

1.2 試驗設計

1.2.1 杏鮑菇的富硒平板培養 配制平板基本培養基，按表1的方案添加亞硒酸鈉，使各處理中的硒濃度依次為4、8、12、16、20、40、80、120、160、200 mg/L。滅菌后倒板，每個處理4個重復，待培養基凝固后接種菌塊，于22 ℃暗培養，菌絲萌發后，每2 d測量1次菌絲生長半徑，直至菌絲長滿平板。

1.2.2 杏鮑菇的富硒液體發酵 配制液體培養基，于250 mL三角瓶中分裝100 mL。準確稱取亞硒酸鈉于各三角瓶中，使液體培養基中的硒濃度依次為4、8、12、16、20、50、100 mg/L，每個濃度3個重復。滅菌后接入3個菌塊，于22 ℃、130 r/min條件下暗培養14 d。收集菌絲球，清洗、過濾并烘干（45 ℃），測定菌球干重（表2）。

1.2.3 栽培基質中添加亞硒酸鈉實驗 在杏鮑菇栽培配方中按表3的方案添加亞硒酸鈉，使栽培基質中的硒濃度分別為10、50、100、150、200、300、600 mg/kg（表3）。充分拌勻，每個處理110包，平均每袋干料重550 g，含水量為65%～68%。裝袋后按常規方式進行滅菌、接種、發菌和出菇管理。記錄菌絲生長速度、子實體農藝性狀和產量等。將杏鮑菇子實體于60 ℃烘干，粉碎研磨后為待測樣品。

1.2.4 蛋白質含量分析 按照國家標準GB 5009.5—2016《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》中的方法，采用凱氏定氮法測定杏鮑菇子實體中粗蛋白的含量。

1.2.5 杏鮑菇子實體中硒含量測定與富集系數分析 按照國家標準GB 5009.93—2017《食品安全國家標準食品中硒的測定》中的方法，采用微波消解-電感耦合等離子體發射光譜法（ICP-AES）測定樣品中總硒含量[9]。富集系數（BCF）：食用菌子實體中某種元素的含量與相應栽培料中該元素含量之比。BCF越大，則說明富集能力越強。

1.2.6 杏鮑菇子實體中硒代氨基酸形態分析 杏鮑菇產品風干樣品研磨處理后，稱取定量樣品溶于水中，加足量蛋白酶水解后利用液相色譜-原子熒光光譜儀聯用（LC-UV-AFS，北京）進行硒代氨基酸形態的測定，可檢測甲基硒代半胱氨酸（MeSeCys）、硒代胱氨酸（SeCys2）、硒代蛋氨酸（SeMet）等3種硒代氨基酸和4價硒[Se（IV）]含量[10-11]。

2 結果與分析

2.1 平板培養條件下硒元素對杏鮑菇菌絲生長的影響

平板培養條件下，杏鮑菇菌絲體對硒的耐受性較強，硒濃度低于160 mg/L時，對菌絲的生長沒有顯著影響;硒濃度大于200 mg/L時，菌絲生長速度呈現顯著下降趨勢（圖1）。在固體培養條件下，杏鮑菇菌絲體生長在培養基表面，與硒的接觸有限，且基質中的硒濃度會隨著菌絲的富集作用而逐漸下降，不會對菌絲體的生長產生毒害作用。此外，PDA培養基中含有的瓊脂等大分子物質可能會與硒元素緊密螯合，也可以降低硒的毒性作用。由此可見，在固體培養條件下進行菌絲對硒的富集，培養基中硒的適宜添加濃度為40～80 mg/L。

2.2 液體發酵條件下硒的添加對杏鮑菇菌絲生物量的影響 ?液體發酵條件下，硒濃度為4 mg/L時，即可對杏鮑菇菌絲體的生長產生顯著抑制（圖2）;當發酵液中的硒濃度達到50 mg/L時，菌絲生長受到強烈抑制，生物量僅為1 g/L;硒濃度達到100 mg/L時，杏鮑菇菌絲停止生長，生物量為0 g/L。液體發酵條件下，振蕩中的菌絲球全方位地接觸硒元素，導致杏鮑菇菌絲體對硒元素非常敏感，菌絲生長速度受到強烈抑制。

2.3 硒元素對杏鮑菇子實體生長發育的影響

栽培基質中添加10～600 mg/kg的硒元素時，杏鮑菇菌絲生長的速度不受影響，菌絲長滿菌袋的時間相近。當基質中硒元素的添加量為10 mg/kg時，杏鮑菇的單位產量[（328.6±24.2） g]與對照組[（308.3±29.3）g]相比顯著提高，之后，隨著硒添加量的增加，產量未發生顯著變化，說明在試驗設計的添加濃度范圍內，微量元素硒對杏鮑菇的產量影響不明顯。此外，與對照相比，各添加配方之間杏鮑菇的農藝性狀并沒有顯著差別，說明亞硒酸鈉的添加對杏鮑菇的農藝性狀無顯著影響（表4）。

2.4 杏鮑菇子實體對硒的富集作用

栽培基質中添加亞硒酸鈉時，杏鮑菇子實體中的硒含量明顯高于對照，且提高程度隨外源硒添加量的升高而增加（表5）。栽培基質中硒元素添加濃度為10 mg/kg時，BCF最高（0.528），富集效果最好;硒添加量為100～200 mg/kg時，子實體硒含量維持在35～40 mg/kg，未呈現明顯提高趨勢。硒添加濃度在300～600 mg/kg時，子實體中的硒含量隨添加濃度的升高相應提高，但BCF基本保持不變。上述結果表明，杏鮑菇具有較強的富硒能力，低濃度時，富集作用較強;高濃度時，富集作用較弱。

2.5 子實體中的硒形態分析及蛋白質含量

LC-UV-AFS測定結果表明，不同硒添加濃度處理中，杏鮑菇子實體中富集到的硒元素主要以SeMet和亞硒酸鹽[（Se（IV）]的形式存在，分別占總硒含量的28.76%～71.38%和25%～61.96%。而硒代胱氨酸（SeCys2）含量和甲基硒代半胱氨酸（MeSeCys）含量占總硒含量的10%以下。采用凱氏定氮法測定杏鮑菇子實體中粗蛋白的含量，發現在栽培基質中補充亞硒酸鈉，可以提高子實體中的蛋白質含量（表6），但蛋白質含量不隨基質中硒添加量的增加而增加，各添加配方之間蛋白質含量差異較小。

3 討論

食用菌菌絲體和子實體中富含蛋白質和多糖，利用食用菌作為富硒載體，可以將無機硒轉化為蛋白硒和多糖硒。食用菌進行硒的生物轉化主要通過向栽培基質或發酵液中添加外源硒（硒酸鈉、亞硒酸鈉、SeMet等）進行人工培養的方式實現的。培養條件不同，食用菌對硒元素的耐受能力不同。本研究表明，杏鮑菇菌絲體在PDA平板培養、液體發酵培養和人工栽培模式下對硒的耐受性存在很大差異。平板培養條件下，加入適量的硒（40～80 mg/kg），可促進杏鮑菇菌絲的生長，但濃度高于160 mg/kg，菌絲生長速度會受到抑制;液體搖瓶培養條件下，杏鮑菇菌絲對硒元素非常敏感，4 mg/L的濃度即可以抑制菌絲的生長，這與孫中濤等[11]報道的低濃度硒即可對香菇菌絲體（液體發酵）產生強烈抑制的結果一致。栽培模式下，菌絲對硒的耐受性非常高，基質中補充600 mg/kg的硒元素，菌絲仍然可以正常生長，且產量與對照相比差異不顯著。基質中補充低濃度（10 mg/kg）硒時，杏鮑菇的單位產量最高，相比對照提高6.6%。由此可見，培養方式不同，杏鮑菇對硒元素的耐受性完全不同。

硒在生物體內富集轉化的同時，SeMet和硒代半胱氨酸取代蛋氨酸和半胱氨酸，參與谷胱甘肽過氧化物酶、碘化甲腺原氨酸脫碘酶等多種蛋白質的合成，具有重要的生理功能[12]。本研究中，栽培基質中添加的硒元素被大量富集至杏鮑菇子實體中，通過生物轉化，主要以4種硒形態存在：即SeMet、SeCys2、MeSeCys和Se（IV）。現有研究表明，富硒食用菌中的有機硒形態主要是SeMet，同時還存在SeCys2、MeSeCys等有機硒形態，部分富硒食用菌中還存在Se（IV）和Se（VI），如富硒香菇子實體中硒主要以SeMet和MeSeCys 2種形態存在[13];硒酸鈉處理的蛹蟲草子實體中主要以SeCys2和SeMet形態存在，還存在少量Se（VI）;硒代蛋氨酸處理下蛹蟲草子實體中硒主要以SeCys2和SeMet形態存在，還存在一種未知的硒形態[14]，這與食用菌種類、外源硒類型和添加量有關。本研究中，富硒杏鮑菇子實體中的硒主要以SeMet和Se（IV）2種形態存在。

目前對富硒食用菌的研究主要集中在培養條件及方式、硒含量和形態，以及營養品質等方面，而食用菌對不同形態硒的吸收通道和轉化過程尚不明確，是未來需要努力攻克的方向。◇

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Abstract：To clarify the tolerance of exogenous selenium to Pleurotus eryngii under different culture conditions，different concentrations of sodium selenite were added to the solid medium，liquid fermentation medium and cultivation substrate，respectively.The tolerance to selenium under different culture conditions were compared，and selenium species in P.eryngii fruiting bodies were also detected.The results showed that selenium concentration，which was less than 160 mg/L，had no significant effect on the growth of mycelia under solid culture condition，while under the condition of liquid culture，4 mg/L of selenium could significantly inhibit the growth of mycelium.In the cultivation mode，10～600 mg/kg of selenium in the cultivation substrate did not affect the growth of mycelia，and the selenium content in the fruiting body increased with the increase of selenium concentration in the cultivation substrate.Selenium speciation analysis of fruiting bodies showed that selenium enriched was in the form of selenomethionine，methylselenocysteine，selenocystine and selenite，among which，selenomethionine was the main form of combination of selenium and amino acids.

Keywords：Pleurotus eryngii;selenium tolerance;selenium species;selenium amino acid