酶解牛骨肽促進骨骼生長功效的研究

陳麗娜 溫宇旗 韓國慶 王耀新 王繼明 杜芳 魏鵬飛 李穎 蘇秀蘭

摘 要：采用低鈣鼠糧飼喂Wistar大鼠，造大鼠低鈣模型，口服給予模型組大鼠酶解牛骨肽3個月，研究酶解牛骨肽對低鈣大鼠促進骨骼生長的作用，測定各實驗組大鼠體重指數以及大鼠股骨重量、股骨強度、骨鈣含量及血清鈣離子含量等多項生理生化指標，同時做體外細胞實驗，研究酶解牛骨肽對成骨細胞MC3T3-E1增殖情況的影響。結果表明：酶解牛骨肽對低鈣大鼠骨鈣含量水平的升高有明顯作用（P<0.05），酶解牛骨肽可以在體外促進成骨細胞MC3T3-E1的增長，說明酶解牛骨肽在一定程度上能夠促進骨骼生長發育。

關鍵詞：酶解牛骨;多肽;低鈣模型;成骨細胞

牛骨肽是酶解法獲得的活性肽，其分子量易控制、沒有苦味、分子量小（≤1 000 U），這些小分子肽不需消化直接吸收，與生物體相容性好，具有優于蛋白質和氨基酸的營養功能[1]。相較蛋白質抗原性低，不容易出現過敏現象，不容易發生變性而失去活性，相較于氨基酸風味更好，比游離氨基酸容易吸收。它具有良好的溶解性，且耐熱、耐酸性好，同時不同來源和不同酶解工藝得到的小分子肽具有不同的生物活性，如免疫調節、降血壓、降血糖、降血脂、抗菌、抗衰老、抗氧化、抗癌、抗微生物、抗毒素、增加骨密度、改善骨骼韌性等[2]。研究發現，骨骼中的蛋白質90%為膠原蛋白、骨膠原及軟骨素，可以有效防止老年人隨著年齡增加導致生理性的鈣缺乏，骨膠原減少等現象，能起到促進皮層細胞代謝和防止人體老化的作用[3-5]。大鼠長期低鈣飲食造成的大鼠低鈣模型是目前研究營養因素導致鈣缺乏使用最多的動物模型，本文研究牛骨肽對低鈣模型大鼠增加骨密度的功效。體外細胞實驗是一種廣泛用于補鈣促進骨骼生長研究的實驗方案[6]，該研究為探討骨骼膠原蛋白肽補充機體鈣質，增加骨骼強度，為研究骨骼膠原蛋白肽新功效，及牛骨肽方面的新產品提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 牛骨膠原蛋白肽的制備 制備工藝為：牛骨→前處理→脫脂（要求最終脂肪含量<5%→牛骨粉碎→過100目標準篩→提取骨膠料液比1∶ 5→氫氧化鈉溶液調pH值至8.0→加入2 500U/g胰蛋白酶1%→50 ℃，酶解7 h→沸水高溫滅活10 min→檸檬酸溶液調pH值至6.0→加入復配蛋白酶酶解，酶與底物比1%→50 ℃，酶解4 h→沸水高溫滅活10 min→過濾5 000 r/min離心5 min→保留濾液→加少量蒸餾水清洗濾渣→活性炭脫色脫苦→冷凍干燥→牛骨多肽原液，得到的牛骨多肽原液多肽含量為2.1%，其中90%以上的多肽其分子量<1 000U。

1.1.2 試劑 胰蛋白酶，廣西南寧龐博生物有限公司;復配蛋白酶，安占美-安琪酵母有限公司;硫酸銅、 硫酸鉀、 硼酸、 氫氧化鈉、 濃硫酸、 鹽酸、 溴甲酚綠指示、甲基紅指示劑 （以上試劑均為分析純），國藥集團化學試劑有限公司;硝酸、高氯酸、氧化鑭、EDTA、碳酸鈣、鈣標準品，中國化學計量院;碳酸鈉標準品，中國化學計量院;福林酚試劑盒，北京鼎國;朗迪碳酸鈣D3顆粒，OTC，北京康遠制藥有限公司生產（生產批號20171207）;低鈣鼠糧、正常鼠糧、MC3T3-E1小鼠成骨細胞，中國科學院上海生科院細胞資源中心;胎牛血清（FBS），天津市灝洋生物制品科技有限公司;MTT，北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司（批號：51L10156）;DMSO、青鏈霉素雙抗、DMEM培養基、胰酶，上海源葉生物科技有限公司。

1.1.3 儀器 精密卡尺;動物解剖器械;EX125DZH電子天平奧豪斯;紅外石英消化爐SKD-20S2，上海沛歐分析儀器有限公司;SKD-800沛歐自動定氮儀，上海沛歐分析儀器有限公司;LDZM-80KCS-Ⅱ立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫療器械;SY-300 型標準分析篩，新鄉市篩分設備有限公司;XW-80A微型渦旋混合儀，上海滬西分析儀器;FE28數顯酸度計，梅特勒托利多（中國）公司;BGZ-246 電熱鼓風干燥箱，上海博迅;FW500 500 g高速中藥粉碎機，天津華鑫儀器;YLS-16A小動物骨骼強度測定儀，北京眾實迪創科技發展有限責任公司;DG50酶標儀，華東電子;XSP-ZCA電子顯微鏡。

1.1.4 實驗動物 出生 4周的斷乳Wistar大鼠72只，清潔級，體重60～75 g，雄性，每組12只。

1.2 方法

1.2.1 Wistar大鼠低鈣模型的建立 參考保健食品檢驗與評價技術規范實施手冊（2003版）[7]上的方案以及周軼琳等[8]方法，建立低鈣大鼠模型。將出生4周的斷乳Wistar大鼠適應1周后，禁食12 h，稱體重，按體重隨機分組，分籠飼養，實驗設置：高（2倍中劑量）、中（以人體推薦劑量的5倍設置劑量）、低劑量組（1/2中劑量），同時設1個低鈣對照組和與相應劑量受試物鈣水平相同的碳酸鈣對照組（如僅設1個碳酸鈣對照組，推薦設立與高劑量鈣水平相同的碳酸鈣對照組）。低鈣飼料標準（150 mg鈣/100g飼料），同時飲用去離子水以避免從飲水中獲得鈣。

低鈣對照組（模型組）每天飼喂低鈣鼠糧，飲用去離子水，灌胃給予3.5 mL/（kg·d）蒸餾水，陽性藥物碳酸鈣對照組每天飼喂低鈣鼠糧，飲用去離子水，按83 mg/（kg·d）灌胃給藥;空白組大鼠每天正常飲食，飲用涼白開水，給予3.5 mL/（kg·d）蒸餾水;高、中、低劑量組每天飼喂低鈣鼠糧，飲用去離子水，均按照3.5 mL/（kg·d）給予受試藥物，牛骨酶解肽原液作為中劑量，高劑量在原液的基礎上進行2倍濃縮，低劑量在原液基礎上進行2倍稀釋（表1）。實驗大鼠飼養3個月，每3 d測1次體重，依據體重計算給藥劑量。

1.2.2 實驗大鼠股骨重量的測定 給藥飼養3個月后，處死，剝離出右側股骨，剝離股骨的時候注意要剝離完整的右側股骨，包括股骨頭部分（圖1）。于105 ℃烤箱中烤至恒重，稱量骨干重。

1.2.3 實驗大鼠股骨強度的測定 首先確定股骨中點：測量股骨全長，通過其中點，沿橫截面方向畫一直線，此為股骨中點（截面），然后使用骨骼強度測定儀，對準中點位置測試股骨最大載荷。將大鼠骨骼取下后，剔除骨骼上附著的肌肉和韌帶，使其保持清潔干燥，放置于載物架上，蓋上防護蓋，運行儀器，顯示屏上顯示骨骼從中點折斷時所受的壓力，即骨骼的最大橫向承壓力，通過骨骼力學性能檢測，可以直接反映骨骼強度，間接反映骨密度。該試驗是研究骨質疏松的有效手段，可以加快研究速度，降低研究成本，實現快速篩選藥物和食品對骨骼組織影響情況。

1.2.4 大鼠骨鈣含量的測定 骨骼中鈣離子含量的測定，依照食品安全國家標準食品中鈣的測定檢測方法——第二法 EDTA滴定法測定[9-10]。鈣與指示劑形成絡合物，以 EDTA 滴定，在達到當量點時，在適當的pH 范圍內，EDTA與鈣形成穩定的金屬絡合物，指示劑游離，此時溶液呈現游離指示劑的顏色，所以根據EDTA用量，計算鈣的含量。試樣中鈣的含量按式（1）計算：

式（1）中：X——試樣中鈣的含量（mg/kg或 mg /L）;T——EDTA 滴定度（mg/mL）;V1——滴定試樣溶液時所消耗的稀釋10倍的 EDTA 溶液的體積（mL）;V0——滴定空白溶液時所消耗的稀釋10倍的 EDTA 溶液的體積（mL）;V2——試樣消化液的定容體積（mL）;1 000——換算系數;M——試樣質量或移取體積（g或 mL）;V3——滴定用試樣待測液的體積（mL）。

1.2.5 酶解牛骨肽對MC3T3-E1成骨細胞的增殖作用 本實驗通過體外培養小鼠成骨細胞實驗，探討酶解牛骨膠原肽對成骨細胞增殖作用的影響，研究膠原短肽的增加骨密度功能。取酶解牛骨膠原蛋白肽適量，用PBS緩沖液稀釋，使濃度成為1、2、4 mg/mL的膠原蛋白肽溶液。MC3T3-E1細胞在含有10%胎牛血清和青鏈雙抗（100×，使用時100倍稀釋，使得青霉素終濃度為100 U/mL，鏈霉素終濃度為100 μg/mL）的DMEM完全培養基中培養，37 ℃，5%的二氧化碳恒溫培養箱中培養。每3 d換1次培養液，培養5～6 d后做細胞傳代。吸去原培養基，用PBS溶液清洗2～3次，然后加入0.5 mL 0.25%的含有1 mmol/L EDTA-4Na的胰蛋白酶，37 ℃消化30 s，顯微鏡下觀察細胞收縮情況，細胞變圓，不再貼壁，且成單一個體，不連接成片，加入10 mL DMEM培養基終止消化，輕輕反復吹打細胞，使細胞懸浮，將液體轉移至滅菌離心管中，1 000 r/min，離心5 min，吸去上清液，加入適量培養液，輕輕吹打，將細胞均勻的懸浮于液體培養基中，然后進行細胞計數，稀釋，計數，使得培養液中的細胞濃度為1×105/mL，然后將已知細胞濃度的培養液，加入96孔板中，加樣量為100 μL/孔，分為空白組（調零）、對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組等5個組，每組設定6個復孔。按照表2進行加樣操作。實驗需要注意，MTT一般最好現用現配，或是將MTT配制成0.5 g/L的溶液，小劑量分裝到EP管中，用避光袋或錫紙等可以遮光的材料包裹好，避免被光分解，-20 ℃長期保存，避免反復凍融。

1.3 統計分析方法

采用SPSS軟件進行ANOVA方差分析，LSD多重比較。

2 結果與分析

2.1 酶解牛骨肽對大鼠股骨重量的影響

與M組對比，陽性藥碳酸鈣D3顆粒對大鼠股骨重量的影響具有顯著性差異，低劑量組、中劑量組、高劑量組均有顯著性差異;與CON組（正常飼養對照組）相比，陽性藥組、中劑量組、高劑量組的受試藥物對大鼠股骨長度和股骨重量的影響具有顯著性差異（表3、圖2）。

2.2 酶解牛骨肽對大鼠股骨硬度的影響

由表4、圖3可知，與M組（低鈣模型組）對比，陽性藥碳酸鈣D3顆粒對大鼠左右股骨強度的影響均具有顯著性差異，低劑量組、中劑量組、高劑量組均有顯著性差異，空白組，即正常飼養組股骨強度有顯著差異，說明造模成功;與CON組（正常飼養對照組）相比，陽性藥組、中劑量組、高劑量組的受試藥物對大鼠左右股骨強度的影響具有顯著性差異。

2.3 酶解牛骨肽對大鼠骨骼含鈣量的影響

由表5、圖4可知，與M組（低鈣模型組）對比，陽性藥碳酸鈣D3顆粒對大鼠骨骼中鈣離子含量的影響具有顯著性差異，中劑量組、高劑量組也具有顯著性差異，低劑量組比低鈣模型組骨骼中鈣離子含量高，但是在P<0.05時不具有顯著性差異;與CON組（正常飼養對照組）相比，陽性藥碳酸鈣D3顆粒對大鼠骨骼中鈣離子含量的影響具有顯著性差異，高劑量組也具有顯著性差異，中劑量組無顯著性差異，但是鈣離子含量比CON組（正常飼養對照組）高，低劑量組與CON組（正常飼養對照組）相比沒有明顯差異。

2.4 酶解牛骨肽對MC3T3-E1成骨細胞的影響

由表6、圖5可知，與對照組相比，P<0.05，中劑組量組和高劑量組的吸光度值有顯著性差異，對照組是在96孔板上正常培養的細胞，經過MTT反應后測得的吸光度值，反映了經過72 h生長后活細胞的數量，各個劑量組是在正常培養的細胞中，加入低、中、高劑量的酶解多肽，經過72 h培養后，發現吸光度值比對照組有所增加，且中劑量組與高劑量組與對照組相比，其活細胞數具有顯著性差異（P<0.05）。正常情況下，細胞培育72 h后，在這一段時間內，細胞會發生一系列生理生化反應，經歷生長、增長、衰老、凋亡等一系列變化，整個體系中會存在凋亡的細胞，也有正在生長的活細胞，通過MTT法可以檢測到體系中活細胞的數量，以吸光度值（OD值）間接反映活細胞數量，OD值越大，說明活細胞數量越多，以上數據顯示，與對照組相比，中劑量組和高劑量組活細胞數更多，且存在統計學意義，說明中劑量和高劑量的酶解多肽對體外培養小鼠成骨細胞的增殖活性具有較強的促進作用。成骨細胞是形成骨組織的細胞，合成并分泌骨基質，參與骨的鈣化，口服膠原蛋白水解物能提高骨骼的新陳代謝和骨密度，低分子量的膠原肽以肽的形式被吸收進入血液，并能通過增加骨骼的有機物部分達到治療骨質疏松的效果[11-12]。

3 討論

以上動物實驗數據分析結果表明，酶解牛骨肽可以增加大鼠股骨強度，增加股骨中鈣離子含量，促進大鼠鈣離子的吸收，促進MC3T3-E1成骨細胞的增殖。實驗設立了模型組，空白組（正常飼養組），高、中、低劑量組，陽性藥組，長時間低鈣飲食可以造成Wistar大鼠暫時性的缺鈣，正常飲食的實驗大鼠體內鈣離子含量與造成低鈣模型后給予低劑量酶解牛骨肽后體內鈣水平相當，說明當大鼠缺鈣時，可以通過恢復正常飲食補鈣，也可以通過服用酶解多肽快速補鈣，高、中劑量組大鼠體內骨鈣含量高于正常飼養組，酶解骨肽可以提高正常飲食大鼠骨鈣含量，說明大鼠需要額外攝入鈣離子，以滿足生長需要，給予中劑量和高劑量牛骨酶解肽組大鼠體內鈣離子水平相差不大，但是說明高劑量的鈣離子不能被人體全部利用，當鈣離子滿足人體正常生理需求之后，就不再增加，多余的鈣離子不沉積在骨骼上，而是被代謝排出體外，因為鈣的代謝受多種因素調節和影響，攝入的鈣只有一部分能被腸道吸收，多余的都隨糞便排出體外[13]。酶解牛骨肽可以促進成骨細胞的增殖，促進骨細胞的生長，對大鼠生長有促進作用，動物骨鈣含量和骨強度都明顯增加，而且不低于碳酸鈣對照組，說明該藥物具有增加骨密度的功效。該酶解牛骨肽既可以增加骨密度，提高骨骼強度，又可以促進骨細胞的快速生長，促進骨的快速形成。1986年Harvey提出了新的鈣吸收理論，認為鈣先是與腸道內的氨基酸或者短鏈多肽結合，然后再以整體的分子狀態被吸收，已有大量試驗證明，多肽可以與金屬離子結合進入粘膜細胞，促進機體對礦質元素的吸收，推測在大鼠的消化腸道內，酶解牛骨肽也可以與鈣離子發生結合形成可溶性復合物，避免鈣離子的沉淀，保證鈣離子能順利到達鈣吸收位點被大鼠吸收[14-16]，從而提高骨鈣含量。酶解牛骨肽可以促進成骨細胞快速生長，推測其對骨細胞表現出類生長因子作用。酶解牛骨肽促進骨骼生長及增加骨骼強度等作用機理仍需做進一步驗證和研究。◇

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Abstract：Using low-calcium rat food to feed Wistar rats，the low-calcium model was created，and the rats in the oral model group were given enzymolysis of bovine bone peptide for 3 months.The effects of enzymolysis of bovine bone peptide on bone growth in low-calcium rats were studied.The body mass index and weight of the femur of rats in each experimental group were determined.A number of physiological and biochemical indicators such as femur strength，bone calcium content，and serum calcium ion content were also performed in vitro cell experiments to study the effect of enzymatic hydrolysis of bovine bone peptide on the proliferation of osteoblasts MC3T3-E1.The results showed that the enzymatic hydrolysis of bovine osteopeptide had significant effect on the increase of bone calcium in low calcium rats（P<0.05），enzymatic hydrolysis of bovine bone peptide can promote the growth of osteoblasts MC3T3-E1 in vitro，indicating that enzymatic hydrolysis of bovine bone peptide can promote bone growth and development to a certain extent.

Keywords：enzymatic hydrolysis of bovine bone;peptides;low calcium model;osteoblasts