用于牛肉摻雜肉成分檢測的熒光PCR方法研究

楊軍輝

摘 要：目的：研究用于牛肉摻雜肉成分檢測的熒光PCR方法。方法：制備不同混合比例的牛肉、豬肉、鴨肉樣品，采用DNA提取方法分別提取牛肉、豬肉、鴨肉的DNA，并以不同源性基因?yàn)榘谢蛟O(shè)定特異性引物和探針;利用熒光PCR的反應(yīng)條件對(duì)DNA實(shí)施擴(kuò)增，分析不同摻雜比例的混合肉樣品。結(jié)果：該方法設(shè)計(jì)的熒光PCR引物和探針具備良好的特異性和敏感性，可有效檢測出相同質(zhì)量牛肉、豬肉、鴨肉的DNA濃度差異，可檢測出牛肉中豬源性成分、鴨源性成分的質(zhì)量百分比，且誤差均在5%以內(nèi)，同時(shí)可檢測實(shí)際牛肉食品中牛源性含量差異，并通過DNA檢測條帶清楚呈現(xiàn)。結(jié)論：該方法具備牛肉中摻雜肉成分檢測的有效性。

關(guān)鍵詞：熒光PCR;成分檢測;DNA提取;引物;探針;特異性;擴(kuò)增條件;敏感性

市場貿(mào)易經(jīng)濟(jì)中，在牛肉中摻雜價(jià)格便宜的豬肉、鴨肉等，冒充牛肉欺騙消費(fèi)者的情況屢屢發(fā)生，嚴(yán)重?fù)p害消費(fèi)者利益。為了更好地保證消費(fèi)者權(quán)益，為肉制品鑒定相關(guān)部門提供肉制品質(zhì)量成分鑒定的有效方法[1-2]，依靠感官和經(jīng)驗(yàn)對(duì)肉質(zhì)品的判斷已經(jīng)不能保證判斷結(jié)果的準(zhǔn)確性，且不滿足相關(guān)部門對(duì)肉類食品摻假的監(jiān)管。因此，研究一種能快速、有效且特異性強(qiáng)的檢測方法，是目前必須解決的問題[3-4] 。本文研究一種用于牛肉摻雜檢測的熒光PCR方法，判斷牛肉中是否有其他肉類的摻入，為肉制品的檢驗(yàn)提供可靠、快捷的方法。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 試劑 動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒，北京索萊寶科技有限公司;核糖核酸酶A，上海江萊生物有限公司;Tap DNA聚合酶，上海捷瑞生物工程有限公司;Premix Ex Taqxuaq，南京森貝伽生物科技有限公司;引物和探針合成、人工全基因合成，上海捷瑞生物工程有限公司;無水乙醇，分析純，上海昆山化工原料有限公司[5];瓊脂糖（西班牙），上海如吉生物科技有限公司。

1.1.2 儀器 實(shí)時(shí)熒光PCR儀，上海士森視覺科技有限公司;高速冷凍離心機(jī)，上海繼普電子科技有限公司;凝膠成像系統(tǒng)，上海勤翔科學(xué)儀器有限公司;電子天平，上海亞津電子科技有限公司;舒適型恒溫混勻儀，杭州佑寧儀器有限公司;絞肉機(jī)，上海臺(tái)乙機(jī)械設(shè)備有限公司;旋渦震蕩儀，北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司;電泳系統(tǒng)，深圳美科儀科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣本制備 本研究使用的豬肉、鴨肉、牛肉均由北京肉制品質(zhì)量檢驗(yàn)中心提供[6]，按照牛肉、鴨肉、豬肉各自不同的比例完成樣本制備（表1）。

1.2.2 DNA提取 選取50 g動(dòng)物肌肉組織樣本，利用絞肉機(jī)將其攪碎后，按照以下方法完成DNA提取：（1）將攪碎的樣本選取一定量放入2 mL離心管中，將預(yù)熱至66 ℃的十六烷基三甲基溴化銨提取液以及3.8 μL蛋白酶K溶液，放于66 ℃舒適型恒溫混勻儀中60 min，并間隔15 min取出顛倒混勻，直至取出。（2）離心機(jī)中放入從舒適型恒溫混勻儀中取出的樣本[7]，并離心15 min后，吸取上清放入至新的離心管中。（3）在旋渦震蕩儀上放入498 μL三氯甲烷和吸取的上清混合液，并旋渦30 s使其充分混勻后，放于離心機(jī)離心15 min。（4）向新的1.5 mL離心管中加入混勻后的樣本以及2.1倍的十六烷基三甲基溴化銨提取液[8-9]，于室溫環(huán)境下放置60 min。（5）將離心管中放置60 min后的樣本，放入離心機(jī)并離心5 min后，將樣本中的上清液提取出來丟棄。（6）向步驟（5）中的離心管中分別加入氯化鈉溶液和三氯甲烷各351 μL，將其放入旋渦震蕩儀上旋渦35 s，使其充分混勻后，取出放置于離心機(jī)并離心15 min。（7）向新的1.5 mL離心管中加入步驟（6）處理后的樣本及0.7倍體積的異丙醇，將其輕搖混勻后放于室溫下25 min。（8）向離心機(jī)上放入步驟（7）獲取的樣本并離心15 min取出，并將樣本中的上清液提取出來丟棄后[10-12]，加入498 μL 75%乙醇，置于旋渦震蕩儀上旋渦35 s，使離心管中樣本的沉淀完全洗滌，放入離心機(jī)并離心15 min。（9）將樣本中上清液提取出來丟棄并將沉淀晾干后，加入49 μL超純水完全溶解后，放入-18 ℃冰箱中，存儲(chǔ)備用[13] 。

1.2.3 熒光PCR檢測 （1）熒光PCR反應(yīng)條件：PCR反應(yīng)體系為35 μL，各成分含量分別為：10×緩沖液3.5 μL，2.5 mmol/L 4×dNTPs 1 μL;引物1.1 μL;氯化鎂2.9 μL;模板11 μL;無菌超純水24 μL;Tap DNA聚合酶2.4 μL（2.4 U/μL）。（2）熒光PCR擴(kuò)增條件：循環(huán)參數(shù)為95 ℃變性4 min，然后運(yùn)行35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循為94 ℃變性30 s，55 ℃變性25 s，75 ℃變性60 s，35個(gè)循環(huán)后75 ℃保溫持續(xù)300 s，形成擴(kuò)增產(chǎn)物。（3）熒光PCR質(zhì)量控制：設(shè)定每個(gè)樣本的熒光PCR檢測均為平行樣本[14]，擴(kuò)增Ct值選取2個(gè)樣的Ct值均值。（4）引物和探針：為了完成對(duì)樣本中牛肉和豬肉的質(zhì)量百分比的檢測[15]，以牛源性基因、豬源性基因和鴨源性基因?yàn)榘谢蛟O(shè)定特異性的引物和探針（表2）。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物及探針的特異性測試

為了驗(yàn)證本研究設(shè)計(jì)引物的特異性，選取豬、鴨、牛、羊、雞的DNA為模板，使用2.5中的引物和探針完成樣本擴(kuò)增。通過圖1～3可以看出，針對(duì)牛源性基因設(shè)計(jì)的特異性引物和探針與其他物種DNA無反應(yīng)，只與牛DNA的會(huì)產(chǎn)生特異性擴(kuò)散曲線;針對(duì)豬源性基因設(shè)計(jì)的特異性引物和探針與其他物種DNA無反應(yīng)，只與豬DNA的會(huì)產(chǎn)生特異性擴(kuò)散曲線;針對(duì)鴨源性基因設(shè)計(jì)的特異性引物和探針與其他物種DNA無反應(yīng)，只與鴨DNA的會(huì)產(chǎn)生特異性擴(kuò)散曲線，說明本研究設(shè)計(jì)的引物和探針均具備良好的特異性。

2.2 引物的靈敏性檢測

為了檢測文中研究的引物在熒光PCR檢測反應(yīng)中的靈敏度，選取樣品V15，利用魚精DNA（2 000 ng/μL）溶液10倍稀釋樣品V15中的牛源性DNA（2 000 ng/μL）、豬源性DNA（2 000 ng/μL）、鴨源性DNA（2 000 ng/μL），獲取稀釋反應(yīng)后DNA樣品，濃度分別為0.2、2、20、200、2 000 ng/μL。當(dāng)獲取的稀釋后樣本DNA濃度下降為0.2 ng/μL時(shí)，牛、豬、鴨源性引物和探針均無法擴(kuò)增出特意曲線，即Ct>40（圖4～6）。

2.3 相同質(zhì)量的牛肉、豬肉、鴨肉所提取的DNA濃度差異 ?為使熒光PCR檢測技術(shù)在對(duì)樣本檢測時(shí)，判斷不同動(dòng)物源性成分的質(zhì)量百分比，需要檢測相同質(zhì)量的牛肉、豬肉、鴨肉提取的DNA濃度差異。分別取牛肉、豬肉、鴨肉各0.02 g和0.04 g完成測試，按照2.3方法提取牛肉、豬肉、鴨肉的DNA，并按照公式d=M/DNA，獲取不同肉類樣品質(zhì)量與該樣品的DNA質(zhì)量數(shù)的比值。通過表3可以看出，當(dāng)質(zhì)量是0.02 g時(shí)，牛d=M/DNA=938.9、豬d=M/DNA=161、鴨d=M/DNA=41.1;當(dāng)質(zhì)量是0.04 g時(shí)，牛d=M/DNA=926、豬d=M/DNA=583.9、鴨d=M/DNA=188.5。質(zhì)量不同時(shí)，d值會(huì)存在操作誤差或者儀器檢測誤差，因此取兩次試驗(yàn)的平均值，即d牛=932.45、d豬=154.95、d鴨=114.8。

2.4 檢測樣本中牛肉、豬肉、鴨肉的質(zhì)量百分比

使用熒光PCR檢測V1～V14樣本中不同動(dòng)物源性成分的質(zhì)量百分比含量，分別從V1～V14樣本中取0.04 g肉樣，實(shí)行熒光PCR檢測，獲取其質(zhì)量百分比結(jié)果。通過表4、表5可以看出，使用熒光PCR可以檢測出所有樣本中摻入的豬肉和鴨肉，并且質(zhì)量百分比的誤差均在5%以內(nèi)，滿足牛肉中摻雜肉成分的檢測需求。

2.5 實(shí)際樣品檢測結(jié)果

為驗(yàn)證本文熒光PCR方法的實(shí)際鑒定檢驗(yàn)情況，從北京某超市購買標(biāo)明主要成分為牛肉的8種肉制品，用本文方法提取DNA并檢測。通過表6、圖7可以看出，使用熒光PCR方法對(duì)8種實(shí)際樣品檢測后，發(fā)現(xiàn)各種牛肉食品中牛源性含量均有不同，且DNA條帶能夠清楚呈現(xiàn)，說明本文方法適用于大部分肉制品的摻入成分檢測。

3 結(jié)論

利用熒光PCR技術(shù)定量檢測牛肉中摻雜肉成分，結(jié)果表明，本研究設(shè)計(jì)的引物和探針具備檢測特異性和敏感性，可有效檢測出樣品中牛肉、豬肉、鴨肉的DNA濃度差異，判斷不同動(dòng)物源性成分的質(zhì)量百分比含量。對(duì)市面上8種牛肉制品實(shí)施檢測發(fā)現(xiàn)，存在未含牛源性成分的牛肉制品，市面上存在假肉現(xiàn)象，本文方法還可應(yīng)用于肉制品中牛源性成分檢測。◇

參考文獻(xiàn)

[1]徐依婷，穆月英.我國城鎮(zhèn)居民食品消費(fèi)需求分析與預(yù)測模擬[J].中國食物與營養(yǎng)，2017，23（7）：46-50.

[2]李祥洲.我國農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全問題治理對(duì)策探討[J].中國食物與營養(yǎng)，2017，23（1）：12-16.

[3]陸俊賢，唐修君，樊艷鳳，等.利用熒光定量PCR技術(shù)鑒別畜禽肉中豬源性成分[J].食品研究與開發(fā)，2017，38（10）：110-112、172.

[4]楊華，汪小福，肖英平，等.牛肉及其制品中摻入雞肉、鴨肉和豬肉的多重?cái)?shù)字PCR快速檢測方法研究[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2017，29（6）：994-1000.

[5]紀(jì)藝，等.幾種動(dòng)物生鮮肌肉組織樣品DNA提取方法的比較研究[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2019，31（9）：1471-1477.

[6]張穎穎，等.液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)摻假牛肉的鑒別及定量研究[J].現(xiàn)代食品科技，2017，33（2）：230-237.

[7]王維婷，等.COI序列應(yīng)用于羊肉摻偽非定向篩查技術(shù)的研究[J].現(xiàn)代食品科技，2019，35（2）：216-222.

[8]謝鳳蓮，孫萬成，羅毅皓.牦牛肉品質(zhì)相關(guān)的去飽和脂肪酶1基因表達(dá)差異分析[J].食品研究與開發(fā)，2019，40（5）：1-5.

[9]胡連霞，孫曉霞，陳啟躍，等.GNM C7-8實(shí)時(shí)熒光PCR系統(tǒng)對(duì)摻假肉制品中多種動(dòng)物源性成分的同時(shí)檢測[J].食品工業(yè)科技，2019，40（14）：240-246.

[10]高志強(qiáng)，等.雙重實(shí)時(shí)熒光PCR定量檢測動(dòng)物產(chǎn)品中牛源性成分[J].生物技術(shù)通報(bào)，2018，34（9）：190-194.

[11]朱揚(yáng)，劉永峰，魏燕超，等.牛肉及其中式加工品中豬肉成分的定性、定量檢測方法研究[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018，51（22）：4352-4363.

[12]劉艷，王鳴秋，李詩瑤，等.基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR和數(shù)字PCR的肉制品中牛源性成分檢測[J].現(xiàn)代食品科技，2019，35（7）：254-260.

[13]石盼盼，李旭，魏法山，等.肉類摻假的分子生物學(xué)檢 ?測[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2017，36（7）：773-777.

[14]馮健，李英花，嚴(yán)昌國.延邊黃牛黑皮質(zhì)素受體-4基因多態(tài)性及其與肉質(zhì)性狀的相關(guān)性分析[J].中國畜牧獸醫(yī)，2017，44（5）：1406-1413.

[15]杜洪振，等.豬牛肉摻假鑒定技術(shù)及其特異性物質(zhì)研究進(jìn)展[J].食品研究與開發(fā)，2017，38（13）：199-204.

Abstract：Objective ? The fluorescent PCR method for the detection of adulterated beef was studied.Method ? The DNA of beef，pork and duck were extracted respectively by DNA extraction method，and the specific primers and probes were set with different homologous genes as target genes，the DNA was amplified by the reaction conditions of fluorescent PCR，and the mixed meat samples with different doping ratios were analyzed.Result ? The results showed that the primers and probes designed by this method had good specificity and sensitivity，could effectively detect the difference of DNA concentration of beef，pork and duck meat of the same quality，could detect the quality percentage of pig derived and duck derived components in beef，and the error was within 5%.At the same time，it could detect the difference of cattle derived content in actual beef food，and through DNA detection the strip was clear.Conclusion ? The method was effective for the detection of adulterated meat in beef.

Keywords：fluorescence PCR;component detection;DNA extraction;primer;probe;specificity;amplification condition;sensitivity