赤松茸多糖的提取及對小鼠免疫力的影響

伍玉蘭 馮婉瀅 張玲雨 王曉琛 張穎穎

摘 要：目的：從赤松茸中提取粗多糖，并探討其對小鼠免疫功能的影響。方法：采用水提醇沉的方法提取赤松茸多糖，取40只雌性昆明小鼠，分為5組，隨后用不同劑量的赤松茸多糖（200、100、50 mg/kg·d）灌胃，7 d后檢測小鼠臟器指數及血清干擾素γ（IFN-γ）指標;用MTT法研究赤松茸多糖對小鼠脾臟細胞、腹腔巨噬細胞體外增殖影響。結果：體內對照研究顯示：赤松茸多糖可有效提高脾臟、胸腺指數及血清IFN-γ水平（P<0.05）;體外對照研究顯示：在區間內，赤松茸多糖可顯著促進脾臟細胞（0.25～2 mg/mL，P<0.05）以及巨噬細胞（0.5～1 mg/mL，P<0.05）增殖。結論：赤松茸多糖對小鼠免疫力有明顯增強作用，對細胞免疫的增強效果尤為顯著。

關鍵詞：赤松茸多糖;IFN-γ;免疫活性;環孢素A;水提醇沉

赤松茸是一種與赤松林樹根共生的野生食用菌[1]，近年來已人工培育成功，是歐美各國栽培的著名食用菌之一，也是聯合國糧農組織推薦發展中國家栽培的食用菌之一[2]，且目前已在我國引種成功。作為具有較高營養價值的食用菌之一，赤松茸子實體中富含蛋白質、維生素、多糖和礦物質等化學成分，其中多糖為其所含重要生物活性物質，具有提升機體免疫能力的功效，這表明赤松茸還具有藥用價值，是珍貴的藥食兩用真菌[3-5] 。近年來，食用真菌的深度開發利用成為研究熱點，多糖是其主要有效成分之一，目前市場上已有的真菌多糖類保健品達上百種[6] 。但赤松茸多糖的相關研究尚少，國內已有研究多集中于赤松茸多糖的發酵條件、抑菌作用、抗氧化活性及對小鼠心血管系統的影響[5]，對其免疫活性的藥理研究報道較少。為深入研究赤松茸多糖對機體免疫功能的影響，本實驗從赤松茸中提取了多糖，以環孢素A建立小鼠免疫缺陷模型，研究赤松茸多糖對小鼠體內免疫的影響，并以脾臟細胞、巨噬細胞對其體外免疫活性進行研究，以期為臨床赤松茸營養食品和藥品開發提供科學依據。

1 材料

1.1 實驗動物

昆明系（KM）小鼠40只，雌性，SPF級，體質量18～20g，購于濟南朋悅動物繁育有限公司，合格證號SCXK（魯）20140007。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑 小鼠血清的IFN-γ試劑盒，北京中科海博科技有限公司，批號：201705;環孢素A、75%乙醇、80%乙醇、丙酮、蒸餾水、生理鹽水、PBS緩沖液，Thermo Fisher Scientific;RPMI-1640培養液，Thermo Fisher Scientific;一次性無菌細胞培養皿，上海廣銳生物科技有限公司;EP管、DragonLab移液器（20、100、200、1 000 μL）及配套吸頭、200目鋼絲網、雙抗（青霉素與鏈霉素混合液），Thermo Fisher Scientific;紅細胞裂解液，Solarbio Life Sciences。

1.2.2 儀器 高速離心機TD5A，鹽城凱特實驗儀器有限公司;LGJ-18A冷凍干燥機，北京四環科學儀器廠有限公司;恒溫磁力攪拌器，環宇科學儀器廠;普朗DNM-9602酶標、N-3010旋轉蒸發儀，EYELA東京理化器械株式會社;BS210S電子天平，Sartorius;數碼生物顯微攝影系統，上海彼愛姆光學儀器制造有限公司;電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司;CO2培養箱，Thermo Fisher Scientific;光學顯微鏡、倒置顯微鏡，奧林巴斯。

2 方法

2.1 赤松茸多糖的提取

如附圖所示[7-8]提取赤松茸多糖。將松茸子實體烘干后粉碎過篩，準確稱取600 g子實體粉末，按料水比1∶ 25加入蒸餾水（g∶ mL），置于恒溫攪拌器中，轉速600 r/min、75 ℃加熱、浸提20 min，離心。重復浸提1次，將兩次上清液合并，用旋轉蒸發儀濃縮至適當體積。然后加入75%乙醇，醇沉，于4 ℃冰箱靜置12 h，離心，收集沉淀，用80%乙醇和丙酮各洗3次。用適量蒸餾水復溶沉淀并冷凍干燥，冷凍干燥后將其配制成1%水溶液。用Sevag試劑（氯仿∶ 正丁醇=4∶ 1）7.5 mL，振蕩15 min，以4 000 r/min的轉速離心3 min，去除游離蛋白，最后再次用75%乙醇沉淀得粗多糖，冷凍干燥后備用。

2.2 體內免疫活性

2.2.1 造模與給藥 將40只雌性小鼠隨機分為5組：正常組、模型組和赤松茸多糖高、中、低劑量組，每組8只。除正常組外，其余各組小鼠均連續3 d腹腔注射環孢素A（100 mg/kg·d），每天1次，建立免疫低下模型小鼠。隨后分別給予赤松茸多糖高、中、低劑量組小鼠多糖溶液（200、100、50 mg/kg·d）連續灌胃7 d，每天1次;正常組和模型組則灌胃等量生理鹽水。

2.2.2 小鼠臟器指數測定 末次給藥后，測定小鼠體質量，摘眼球取血，脫頸椎處死，分離胸腺和脾臟并稱重。根據式（1）、（2）計算各組小鼠胸腺指數和脾臟指數：

2.2.3 IFN-γ含量測定 收集小鼠血清，用ELISA法測定各組小鼠血清IFN-γ含量。按照ELISA試劑盒說明書上的步驟操作，測得相應OD值。據此繪制標準曲線并求得其線性方程為y=1 552.6x-100.56，相關系數R2=0.994 3，表示在一定范圍內線性關系良好，最后根據該曲線求出對應IFN-γ含量。

2.3 體外免疫活性

2.3.1 配制藥液 赤松茸多糖用PBS配制成濃度為50 mg/mL的藥液，無菌過濾，用前濃度稀釋為10 mg/mL。

2.3.2 小鼠脾臟細胞的增殖實驗 制備小鼠脾臟細胞懸液[9]，臺盼藍染色檢測細胞生存率大于95%，調整懸液細胞濃度為1.5 ×106個/mL。將該細胞懸液加入96孔板，每孔加入100 μL。多糖組加入赤松茸多糖藥液，每孔100 μL，使多糖最終濃度分別為0.062 5、0.125、0.25、0.5、1、2 mg/mL，空白組則加入等體積的雙抗RPMI-1640培養液（10%胎牛血清、青霉素100 U/mL、鏈霉素100 μg/mL）。最后采用MTT法進行體外培養，將脾臟細胞置于37 ℃、5% CO2條件下孵育44 h后取出，參照文獻方法[9]進行OD值檢測。

2.3.3 小鼠腹腔巨噬細胞的增殖實驗 制備小鼠腹腔巨噬細胞懸液[10]，臺盼藍染色檢測細胞生存率大于95%，調整懸液細胞濃度為2×106個/mL。將該細胞懸液接種于96孔板，每孔150 μL，在37 ℃、5% CO2條件下培養3 h，取出，棄上清液，用PBS緩沖液洗滌3次去除未貼壁細胞，得純化小鼠腹腔巨噬細胞。在上述純化后巨噬細胞96孔板中，多糖組加入赤松茸多糖藥液，每孔100 μL，使多糖最終濃度分別為0.06、0.12、0.25、0.5、1、2 mg/mL，空白組則加入等體積的雙抗RPMI-1640培養液。按2.3.2方法進行細胞培養及OD值測定。

2.4 統計學方法

采用SPSS 25.0軟件進行數據分析。計量資料用±s表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，檢驗水準（α）為0.05。

3 結果與分析

3.1 赤松茸多糖對小鼠臟器指數的影響

如表1所示，模型組與正常組比較，模型組胸腺指數、脾臟指數均低于正常組，表示造模成功。赤松茸多糖高、中、低劑量組與模型組相比，赤松茸多糖對小鼠胸腺增長有一定促進作用，胸腺指數增大，差異有統計學意義（P<0.05）;同時對小鼠脾臟也有促增長作用且隨著劑量增加，脾臟指數增大，但差異無統計學意義（P>0.05）。

3.2 赤松茸多糖對小鼠血清IFN-γ含量的影響

如表2所示，模型組與正常組比較，血清IFN-γ含量明顯降低，表明建模成功。與模型組相比，高劑量組IFN-γ含量顯著升高（P<0.05），且與中、低劑量組差異明顯，說明高劑量組可顯著升高免疫低下小鼠IFN-γ含量。

3.3 赤松茸多糖對小鼠脾臟細胞的影響

如表3所示，與空白組比較，OD值在0.25～2 mg/mL濃度區間內明顯增大（P<0.05），表明此濃度區間內赤松茸多糖對小鼠脾臟細胞的增殖有明顯刺激作用并隨濃度的增加作用增強，存在劑量依賴性;OD值在0.125 mg/mL濃度時略有增大，在 0.062 5 mg/mL濃度時略有減小，且兩者與空白組相比均無統計學差異（P>0.05）。

3.4 赤松茸多糖對小鼠腹腔巨噬細胞的影響

如表4所示，與空白組比較，OD值在2 mg/mL濃度時明顯減?。≒<0.05），在0.5 mg/mL與1 mg/mL濃度時明顯增大（P<0.05），表明赤松茸多糖在0.5 mg/mL和1 mg/mL濃度時對小鼠腹腔巨噬細胞的增殖具有刺激作用且呈現出一定劑量依賴性;但OD值在0.06～0.25 mg/mL濃度區間內雖增大但無統計學差異（P>0.05）。

4 討論

多糖是植物的有效成分之一[11]，同時也廣泛分布于香菇、銀耳、雞蓯菌等真菌中[12] 。現代藥理研究證明，真菌多糖具有免疫調節、抗腫瘤、抗病毒、抗凝血、抗放射、抗衰老等功效[13] 。環孢素A為11個氨基酸組成的環狀多肽，是從霉菌代謝產物中提取得到的第三代免疫抑制劑，對體液免疫和細胞免疫都有較好的抑制作用[14] 。本實驗以環孢素A（100 mg/kg·d）連續3 d對小鼠進行腹腔注射，成功構建免疫低下小鼠模型。

脾臟是人體最大的外周免疫器官，是T/B淋巴細胞定居和發生免疫應答的主要場所;胸腺是人體的中樞免疫器官，是T淋巴細胞發育成熟的場所，二者均對機體免疫反應起著重要作用。因此胸腺和脾臟可作為評判機體免疫功能強弱的指標[15] 。本研究體內實驗顯示，赤松茸多糖可有效提高小鼠胸腺、脾臟指數。其中，胸腺指數相較于模型組差異具有統計學意義，說明赤松茸多糖能增強小鼠胸腺功能，提高小鼠免疫力。而脾臟指數雖有提高，但差異無統計學意義，說明其可能也潛在地增強了脾臟功能。體外增殖實驗顯示，赤松茸多糖在0.25～2 mg/mL濃度區間內能夠明顯刺激脾臟細胞的增殖且該作用存在明顯的量效關系，體內外免疫實驗趨勢一致，均說明赤松茸多糖能夠有效提高機體免疫應答。

巨噬細胞是體內一種重要的固有免疫細胞[16-17]，可吞噬并消化細胞殘片與病原體，進而清除衰老細胞[18]、抵擋病原微生物的入侵。因此，通過測定藥物干預后巨噬細胞的增殖情況，可有效反映藥物對機體免疫功能的影響。IFN-γ是細胞免疫中的主要細胞因子之一，可由Th1細胞分泌，能促進Th1細胞自身的增殖分化，同時具有直接促進T/B細胞分化成熟的作用[19]，從而促進機體免疫應答[20] 。本研究體內實驗表明，赤松茸多糖可明顯提高小鼠血清中IFN-γ的含量，且有一定的劑量依賴效應，提示在一定程度內適量增加松茸多糖劑量可進一步增強小鼠免疫功能。此外，小鼠體外腹腔巨噬細胞增殖實驗表明，赤松茸多糖在0.5 mg/mL與1 mg/mL濃度時能夠明顯刺激巨噬細胞的增殖，且該作用存在明顯的量效關系。

綜上所述，赤松茸多糖能夠有效調節機體免疫器官胸腺、脾臟功能以及某些細胞因子如IFN-γ的分泌，從而增強機體免疫力。松茸多糖作用于環孢素A所致免疫缺陷小鼠后，可有效提高其胸腺、血清IFN-γ水平，作用于體外培養脾臟細胞及巨噬細胞，均可促進其增殖，說明該多糖對小鼠的細胞免疫有較好調節作用，有望作為免疫刺激增強劑進一步深入開發。◇

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Abstract：Objective ? To extract the crude polysaccharide from Stropharia rugoso-annulata，and to explore its effect on the immune function of mice.Method ? The polysaccharide of Stropharia rugoso-annulata was extracted by the method of water extraction and alcohol precipitation，40 mice were divided into 5 groups，and the mice were given intragastric administration with different doses of the polysaccharides（200，100，50 mg / kg·d），and the organ index and the serum IFN-γ index were detected after 7 days.The effect of Stropharia rugoso-annulata polysaccharide on the proliferation of spleen cells and peritoneal macrophages in mice was studied by MTT method.Result ? In vivo control study showed that Stropharia rugoso-annulata polysaccharide could effectively increase the level of spleen，thymus index and serum IFN-γ（P<0.05）.In vitro control study showed that Stropharia rugoso-annulata polysaccharide could significantly promote the proliferation of spleen cells（0.25～2 mg/mL，P<0.05）and macrophages（0.5～1 mg/mL，P<0.05）in the interval.Conclusion ? Stropharia rugoso-annulata polysaccharide has a significant effect on mouse immunity，especially on cellular immunity.

Keywords：the polysaccharide from Stropharia rugoso-annulata;IFN-γ;immune activity;cyclosporine A;water-extraction-alcohol-precipitation method