表沒食子兒茶素沒食子酸脂聯合阿米福汀對小鼠卵巢的輻射保護作用

李孝鵬 王章桂 魏 南

2018年世界腫瘤統計數據表明：全世界新發腫瘤人數為1 810萬，死亡人數為960萬[1]，放療是腫瘤主要治療手段之一，放射線對腫瘤周圍正常組織損傷是引起放療副反應的重要基礎，阿米福汀(amifostine,WR-2721)作為輻射保護劑，具有清除自由基、轉移氫離子和穩定DNA的作用，放療前15分鐘使用WR-2721，可以降低放射線引起的腫瘤周圍正常組織損傷[2]。表沒食子兒茶素沒食子酸脂(epigallocatechin-3-gallate,EGCG)是綠茶的主要活性成分，具有清除自由基，降低輻射引起的正常組織損傷，提高腫瘤細胞對放射線的敏感性[3]。卵巢對放射線非常敏感，即使接受<2 Gy X線照射，也會導致50%的卵母細胞結構破壞，6 Gy X線照射可引起30歲女性卵巢中度功能障礙，隨著照射劑量的繼續增加，可引起急性卵巢功能衰竭、不孕、絕經[4]，絕經前婦女放療時，須注意卵巢的輻射保護。本研究探討EGCG在輻射引起的小鼠卵巢損傷中的作用，明確聯合WR-2721在輻射損傷中的意義，為探索新型輻射保護劑提供基礎依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 雌性SPF級6～8周ICR小鼠150只，購自安徽醫科大學動物中心，動物許可證號：SYXK(皖)2017-0012],體質量24.12～31.77 g，平均(28.07±2.02)g，飼養室溫度20℃，相對濕度50%，充足的食物及水供應。

1.1.2 藥品及試劑 EGCG(每瓶0.5 g，批號E8307，南京道斯夫生物技術有限公司)；WR-2721(每瓶0.4 g，批號H20010403，大連美羅大藥廠)；注射用孕馬血清促性腺激素(每瓶1 000 IU，批號 S160907，寧波三生藥業有限公司)；TUNLE試劑盒(瑞士Roche公司)。

1.1.3 儀器 Precise直線加速器(瑞典醫科達公司)；BC-5300血細胞分析儀(深圳邁瑞公司)；DMD108顯微鏡(德國徠卡公司)；BT25S分析天平(德國賽多利斯公司)。

1.2 動物分組、模型建立及標本采集

1.2.1 動物分組 小鼠編號后，按照隨機數字法分為Sham組(不接受輻射)、Control組(接受輻射，不接受WR-2721或EGCG治療)、WR組(接受輻射和WR-2721治療)、EGCC組(接受輻射和EGCG治療)和WR+EGCG組(接受輻射以及WR-2721和EGCG聯合治療)，每組30只。

1.2.2 模型建立 輻射前48小時，所有小鼠腹腔注射5 IU孕馬血清促性腺激素，統一動情周期；輻射前2小時，將EGCG(40 mg/kg)經口服給藥方式給相應組別的小鼠；輻射前15分鐘，將WR-2721 (300 mg/kg)經腹腔注射方式給相應組別的小鼠；輻射方法：小鼠固定在特制的盒子內接受6 Gy X線照射，劑量率為600 cGy/min，放射源到小鼠的距離為100 cm。

1.2.3 標本采集 輻射后第8小時、第3、7、10、14天測小鼠體質量，第8小時、第7天和第14天處死小鼠，每次每組10只小鼠禁食、禁水6 h，腹腔注射10%的水合氯醛(4 mL/kg),麻醉后摘除眼球取20 μL的血液，放入含EDTA-K2抗凝劑的離心管；取小鼠雙側卵巢，稱重后，一側置于4%甲醛溶液中，另一側置于RNA保護液中，計算卵巢指數[卵巢指數=卵巢質量(g)/小鼠體質量(g)×100%]。

1.3 觀測指標及測定方法

1.3.1 一般情況觀察 每2天稱小鼠體質量1次，觀察并記錄其體質量變化、飲食情況、毛色、精神狀態等。

1.3.2 血細胞測定 用血細胞分析儀測定各組小鼠白細胞、紅細胞、血紅蛋白和血小板計數。

1.3.3 卵巢病理學檢查 小鼠卵巢經4%甲醛溶液充分固定后，分別以70%、80%、90%、95%、100%濃度的乙醇對組織進行脫水，二甲苯透明，石蠟包埋、切片后，將切片放在二甲苯中脫蠟20 min，然后在100%、95%、90%和80%乙醇各浸1 min，HE染色。在光學顯微鏡下，觀察卵巢組織的病理形態學變化。

1.3.4 細胞凋亡及凋亡指數檢測 采用TUNEL細胞凋亡試劑盒檢測卵巢細胞凋亡,每組隨機選取3只小鼠，共200個卵泡，卵泡中30%的顆粒細胞染色呈陽性時，判定該卵泡凋亡[5]。凋亡指數為卵泡中染色陽性顆粒細胞數占顆粒細胞總數的百分比。

2 結果

2.1 輻射后體質量和血象變化 小鼠體質量存在組別和時間點的交互作用，Control組小鼠輻射后第7天，體質量顯著下降，后緩慢恢復。Sham組小鼠體質量持續增長，WR、EGCG、WR+EGCG組小鼠輻射后，體質量緩慢上升，不同時間點測量小鼠體質量差異有統計學意義(P<0.05)；WR、EGCG組小鼠體質量與Control組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，WR+EGCG組與Control組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 5組小鼠不同時間點體質量比較

小鼠白細胞、紅細胞存在組別和時間點的交互作用，與Sham組比較，輻射后小鼠白細胞數均降低,Control組下降幅度最顯著(P<0.05)，見表2；輻射后第14天，WR、EGCG、WR+EGCG組紅細胞數均高于Control組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表3；各組血紅蛋白水平輻射后變化不大，見表4；輻射后第7天，與WR+EGCG組相比，Control組小鼠血小板計數降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表5。

表2 5組小鼠白細胞變化比較

表3 5組小鼠紅細胞變化比較

表4 5組小鼠血紅蛋白比較

表5 5組小鼠血小板比較

2.2 卵巢形態及卵巢指數變化 輻射后8小時，Sham組、Control組和WR+EGCG組卵泡形態無明顯差異。輻射后第7、14天，與Sham組相比，Control組的卵泡平均數量明顯減少，出現大量閉鎖卵泡或空卵泡，WR、EGCG組存在少量的閉鎖卵泡或空卵泡，而WR+EGCG組未見閉鎖卵泡或空卵泡。見圖1。

圖1 輻射后小鼠卵巢組織形態學比較(指向三級卵泡,表示閉鎖卵泡,CL為黃體)(HE,×40)

小鼠卵巢指數存在組別和時間點的交互作用，進一步按時間點分層比較，輻射后8小時，5組小鼠的卵巢指數比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表6。輻射后第7天，與Sham組及WR+EGCG組相比，Control組小鼠卵巢指數顯著下降，差異有統計學意義(P<0.05)，WR、EGCG及WR+EGCG組小鼠卵巢指數輕度下降，且3組之間差異無統計學意義(P>0.05)。輻射后第14天，EGCG組及WR+EGCG組小鼠卵巢指數高于Control組，差異有統計學意義(P<0.05)。

表6 5組小鼠卵巢指數比較

2.3 卵巢細胞凋亡變化 所有組別中，Control組TUNEL染色陽性的閉鎖卵泡及凋亡顆粒細胞最多。見圖2。卵巢顆粒細胞凋亡指數存在組別和時間點的交互作用，與Sham組比較，接受輻射的卵巢顆粒細胞凋亡指數均升高，Control組最高,EGCG組和WR組凋亡指數升高介于Control組及WR+EGCG組之間，差異有統計學意義(P<0.05)。見表7。

圖2 卵巢組織陽性細胞核呈棕黃色，固縮成團或聚成環狀，或碎裂，形成凋亡小體(IHC,×100)

表7 5組小鼠卵巢凋亡指數比較

3 討論

既往研究[5-6]表明接受大劑量輻射后，小鼠出現煩躁不安，反應遲鈍，飲食量下降，體質量減輕等改變。骨髓及造血系統嚴重破壞，表現為骨髓細胞大量死亡，有核細胞及造血干細胞急劇減少，外周血細胞減少，尤其是白細胞，對血小板及紅細胞影響稍小。本研究結果顯示，接受輻射后第7天，Control組小鼠體質量降至最低點，后緩慢恢復，WR、EGCG及WR+EGCG組小鼠體質量未見降低，但增長幅度變緩，輻射對WR+EGCG組小鼠體質量影響最小。輻射可致外周血中白細胞降低，對血小板、紅細胞及血紅蛋白影響較小，WR-2721和EGCG能降低輻射后外周血細胞計數下降程度，聯合用藥對外周血細胞保護作用更顯著。因此，EGCG聯合WR-2721可預防小鼠輻射后體質量下降，降低放射線對骨髓的損傷，維持血細胞水平。

卵巢由卵母細胞和顆粒細胞組成，顆粒細胞圍繞著卵母細胞形成一個功能性的卵泡單元，顆粒細胞與卵母細胞的雙向調節促進卵泡發育成熟。動物實驗表明，卵巢極易受到輻射損傷，電離輻射暴露后數小時，分裂的顆粒細胞功能最早受到影響，顆粒細胞和卵母細胞之間雙向調節減少，卵泡發育受到損傷，導致卵巢早衰和不孕，卵母細胞的遺傳DNA也可能被破壞，并傳遞給子代。不同發育階段的卵母細胞對輻射損傷的敏感性不同，靜止的原始卵泡抗輻射能力最強，成熟的竇狀卵泡對輻射最敏感。輻射還會引起卵巢血管基質萎縮和纖維化，最終導致卵母細胞死亡和卵泡閉鎖[7-9]。本研究中，小鼠接受輻射后，不同發育階段的卵泡顯示出明顯的變形，晚期閉鎖卵泡顆粒層附近空腔內可見核固縮和凋亡細胞碎片，閉鎖卵泡數量顯著增加。輻射后第7天，小鼠卵巢凋亡顆粒細胞數量多于第8小時的數量，具有閉鎖特征。Control組小鼠卵巢凋亡指數升高，WR、EGCG及WR+EGCG組凋亡指數也升高，但均低于對照組，尤其是WR+EGCG組。Control組小鼠卵巢指數下降，WR、EGCG及WR+EGCG組卵巢指數輕度下降，WR+EGCG組小鼠指數下降幅度最低。因此，WR-2721、EGCG可協同逆轉輻射引起的顆粒細胞凋亡作用。

WR-2721進入體內后生成具有活性的硫醇自由基和WR-1065，可清除放療過程中組織產生的自由基，以P53依賴的方式保護細胞免受細胞毒效應，與DNA核蛋白結合后，改變染色體核小體間的結構，降低細胞凋亡。WR-2721半衰期約30 min，部分患者使用后，可出現為頭暈、惡心、嘔吐、乏力等癥狀[10]。EGCG使用方便且基本沒有副反應，Ⅱ～Ⅲ期臨床研究[3,11]表明，肺癌、食管癌放化療期間每日口服EGCG能明顯降低放射性食管炎發生率，且服用時間越早，效果越好，對出現的放射性食管炎治療效果確切。放射性食管炎作用機制可能為：①EGCG能降低血清丙二醛水平，提高血清總超氧化物歧化酶活力，上調Nrf2-ARE信號途徑增加抗氧化酶表達，提高機體抗氧化能力[12]；②放療引起組織DNA Rad23b和Ddit3啟動子高甲基化和表達降低來逆轉輻射損傷[13]；③通過清除過多的活性氧或促進已發生轉化的異常細胞的凋亡。

綜上所述，EGCG可以降低輻射后卵巢顆粒細胞凋亡，減少卵巢閉鎖，保護卵巢形態與功能，作用機制與WR-2721不同，兩者聯合使用對輻射后的卵巢保護作用更顯著，且EGCG為綠茶提取物，安全性更高。