非洲豬瘟病毒微滴式數字PCR檢測方法的建立與應用

嚴 禮，宋 晟，張繼紅，唐小蘭，張海韻，郭焜鵬

(食品安全監測與預警湖南省重點實驗室，湖南省食品質量監督檢驗研究院，長沙410117)

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的一種豬的急性、出血性傳染病，因其嚴重危害養豬業，且無有效的疫苗防治，世界動物衛生組織（Office Inter-national des Epizooties，OIE）將其列為法定上報傳染病。我國將其列為一類傳染病，在國務院辦公廳印發的《國家中長期動物疫病防治規劃（2012－2020年）》中，非洲豬瘟是作為13種重點防范的外來動物疫病之一[1-4]。非洲豬瘟于2007年4月在格魯吉亞爆發，同年11月，俄羅斯發生首例非洲豬瘟，并逐漸蔓延至俄羅斯遠東地區。2018年非洲豬瘟在我國蔓延，嚴重威脅我國養豬業的發展，個別省份發生大規模的生豬減產，并存在非洲豬瘟病死豬肉流入市場的風險。因此，建立一種特異性強、靈敏度高、重復性好的病毒檢驗方法迫在眉睫[5-9]。

微滴數字 PCR（droplet digital PCR，ddPCR）是近幾年出現的新一代聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術。利用油包水技術將反應液分割為數萬個納米級大小的微滴，每一個微滴都是一個獨立的PCR反應體系，當PCR擴增完成后，利用微滴分析儀逐個對每個微滴進行檢測，再根據統計學中的泊松分布原理分析陽性微滴的個數與比例，即可得出靶分子的起始拷貝數或濃度，從而實現對低至單個拷貝核酸分子的絕對定量。與傳統實時熒光定量 PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）方法相比，它不依賴于標準曲線，因而定量結果更為精確，同時也使體系受反應抑制因子的影響大大降低[10-17]。

本研究根據非洲豬瘟病毒核酸的2段保守序列（VP72和K205基因），合成3對引物和探針，通過反應條件摸索，方法優化，比較不同引物、探針之間線性、特異性、靈敏性和重復性的優劣，并建立非洲豬瘟病毒的ddPCR檢測方法。這有利于了解和控制非洲豬瘟疫情，也有利于嚴控非洲豬瘟病死豬肉及豬肉制品在市場上的銷售，切實保障人民群眾的身心健康。

1 材料與方法

1.1 材料

質粒小量抽提試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司上海]，磁珠法病毒DNA/RNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司北京），非洲豬瘟檢測試劑盒（迪澳生物科技有限公司廣州），豬瘟病毒檢測試劑盒（萊普生信息科技有限公司洛陽），豬藍耳病病毒檢測試劑盒（萊普生信息科技有限公司洛陽），微滴數字PCR Supermix for Probes及微滴數字PCR相關試劑（Bio-Rad公司美國）。

1.2 儀器

QX200微滴式數字PCR儀（Bio-Rad公司美國），CFX96 Touch熒光定量PCR儀（Bio-Rad公司美國）。

1.3 引物、探針與重組質粒的設計與合成

第一組引物、探針與重組質粒：參照《OIE陸生動物診斷與疫苗手冊》[18]非洲豬瘟qPCR檢測方法中的引物和TaqMan熒光探針序列，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行合成。上游引物序列F為：5'-CTGCTCATGGTATCAATCTTATCGA-3'；下游引物序列R為：5'-GATACCACAAGATCRGCCGT-3'；探針（Probe）為：CCACGGGAGGAATACCAACCCAGTG。探針的5'端標記熒光報告基團羧基熒光素（5-carboxyfluorescein，FAM），3'端標記熒光淬滅基團黑洞猝滅基團（black hole quencher-1，BHQ1）。VP72序列為：CTGCTCATGGTATCAATCTTATCGATAAATTTCCATCAAAGTTCTGCAGCTCTTACATACCCTTCCACTACGGAGGCAATGCGATTAAAACCCCCGATGATCCGGGTGCGATGATGATTACCTTTGCTTTGAAGCCACGGGAGGAATACCAACCCAGTGGTCATATTAACGTATCCAGAGCAAGAGAATTTTATATTAGTTGGGACACGGATTACGTGGGGTCTATCACTACGGCTGATCTTGTGGTATC。質粒載體為pUC57。

第二組引物、探針與重組質粒：參照T/CVMA5-2018《非洲豬瘟病毒實時熒光PCR檢測方法》[19]非洲豬瘟qPCR檢測方法中的引物和TaqMan熒光探針序列，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行合成。上游引物序列F為：5'-ATAGAGATACAGCTCTTCCAG-3'；下游引物序列R為：5'-GTATGTAAGAGCTGCAGAAC-3'；探針（Probe）為：TATCGATAAGATTGAT。探針的5'端標記熒光報告基團FAM，3'端標記熒光淬滅基團BHQ1。VP72序列為：ATAGAGATACAGCTCTTCCAGACGCATGTTCATCTATATCTGATATTAGCCCCGTTACGTATCCGATCACATTACCTATTATTAAAAACATTTCCGTAACTGCTCATGGTATCAATCTTATCGATAAATTTCCATCAAAGTTCTGCAGCTCTTAC。質粒載體為pUC57。

第三組引物、探針與重組質粒：參照鄔旭龍等[11]的《非洲豬瘟病毒微滴數字PCR（ddPCR）方法的建立及應用》非洲豬瘟qPCR檢測方法中的引物和TaqMan熒光探針序列，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行合成。上游引物序列F為：5'-CAGGCAAAACAAGTGAAACA-3'；下游引物序列R為：5'-GCAAACTGCTCATCCAATAT-3'；探針（Probe）為：TGTTCTTCACGCGTAGCGAATGGGC。探針的5'端標記熒光報告基團FAM，3'端標記熒光淬滅基團BHQ1。K205序列為：CAGGCAAAACAAGTGAAAC-ACCTAAAAAAAATCCCACGAATGCAATGTTCTTCACGCGTAGCGAATGGGCATCCTCGAAAACTTTTCGAGAAAAGTTTTTAACACCAGAAATTCAGGCCATATTGGATGAGCAGTTTGC。質粒載體為pUC57。

1.4 微滴數字PCR反應體系及條件

微滴數字PCR設置上、下游引物各1 μL（濃度為 500 nmol/L），探針 0.5 μL（濃度為 250 nmol/L），ddPCR Super mix for Probes 10 μL，DNA 模板 5 μL，加 ddH2O至20 μL。利用 Bio-Rad QX100數字 PCR微滴生成儀將20 μL體系混合物合成微滴，再利用Bio-Rad T100 PCR儀進行擴增。ddPCR反應條件為：95 ℃預變性 10 min，94 ℃變性 30 s，50～60 ℃退火1 min，40個循環，98℃微滴固化10 min，4℃保存。PCR反應結束后，利用Bio-Rad QX200微滴分析儀讀取DNA拷貝數。

1.5 特異性試驗

以豬瘟病毒（classical swine fever virus，CFSV）和豬藍耳病病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRSV）的保守序列重組質粒為模板，用非洲豬瘟病毒微滴數字PCR試驗方法進行檢測，評估該方法的特異性。

1.6 方法檢出限、線性范圍與重復性試驗

將重組質粒以10倍的梯度進行稀釋，取5 μL作為模板DNA進行ddPCR和qPCR檢測，每個梯度質粒含量分別為 0.1、1.0、10.0、100.0、500.0 fg，每個梯度做3次平行檢測。評估方法的檢出限、線性及重復性。

2 結果與分析

2.1 非洲豬瘟病毒微滴數字PCR方法的優化

設置 60、59、58、56、54、52、51、50 ℃梯度的退火溫度，從左至右，藍色微滴顯示為陽性微滴。引物探針1的退火溫度越低陽性微滴熒光信號越強；引物探針2的陽性微滴熒光信受退火溫度影響不明顯；引物探針3的退火溫度越低，陽性微滴熒光信號越低。綜合這3組引物探針的擴增效果，本研究最終選擇了58℃作為退火溫度。

在以此確定的反應條件下，引物探針1的陰陽性微滴劃分閾值劃定在熒光強度為1 000的位置，引物探針2和引物探針3的陰陽性微滴劃分閾值均劃定在熒光強度為2 000的位置（圖1）。

2.2 ddPCR檢測方法特異性

3對引物、探針均采用CFSV重組質粒、PRRSV重組質粒及蒸餾水對ddPCR檢測方法的特異性進行驗證，均無顯著非特異性擴增，表明非洲豬瘟ddPCR檢測方法具有良好的特異性（圖2）。引物探針1的假陽性率為每反應0.4個陽性微滴；引物探針2的假陽性率為每反應0.0個陽性微滴；引物探針3的假陽性率為每反應0.6個陽性微滴。由于假陽性為小概率事件，所以根據泊松分布建立模型，以假陽性率估計得到的引物探針1的空白限（limit of blank，LoB）為1拷貝ASFV基因，引物探針2的空白限為0拷貝ASFV基因，引物探針3的空白限為2拷貝ASFV基因。單個反應體系中待測樣本濃度低于空白限以下為檢測灰區，無法判定陰陽性，且各引物探針的檢出限必須高于空白限且存在顯著差異。

2.3 ddPCR檢測方法靈敏度與線性范圍

將重組質粒以10倍的梯度進行稀釋，并配置PCR反應體系，得到終質量濃度分別為0.1～500 fg/反應的樣品，而后進行ddPCR檢測。所有ddPCR反應生成的微滴數目均大于10 000滴，表明所有反應微滴均正常生成，保證了后續定量分析的準確性。試驗表明，ddPCR的檢測范圍是101～106拷貝數/反應，所有檢出限均高于空白限，結果可靠，其中引物探針3的檢測線最低，為2.73拷貝數/反應（表1）。從根據檢測結果繪制的標準曲線中可發現，樣品DNA濃度在101～106拷貝數/反應之間時，ddPCR檢測結果呈良好的線性關系，3組引物探針的R2都大于0.990 0，適合定量檢測的需要（圖3）。

2.4 ddPCR檢測方法重復性

重復性試驗結果顯示，3組引物探針在0.1 fg/反應質量濃度下檢測變異系數較高（36.09～117.22），而在質粒的質量濃度為1～500 fg/反應范圍內，3組引物探針檢測變異系數均低于15，具有良好重復性，因此定量質粒的質量濃度范圍為1～500 fg/反應（表2）。

表1 非洲豬瘟ddPCR和qPCR檢測檢出限比較Tab.1 Comparative detection limit of the ASFV ddPCR and qPCR assays

圖1 非洲豬瘟病毒微滴數字PCR退火溫度條件Fig.1 Temperature conditions of African swine fever virus droplet digital PCR

圖2 ddPCR非洲豬瘟病毒方法特異性試驗Fig.2 Specificity of African swine fever virus ddPCR method

圖3 ddPCR非洲豬瘟病毒方法標準曲線Fig.3 Standard curve of African swine fever virus ddPCR method

表2 非洲豬瘟ddPCR重復性試驗Tab.2 Repeatability of ASFV ddPCR

3 討論

隨著非洲豬瘟于2018年在我國被發現，至今已在全國形成了一定的污染面。養豬場戶的防疫意識普遍薄弱，防疫水平整體低下，清洗消毒措施難以完全落實到位，養殖環節疫情傳播風險持續存在，同時還存在帶非洲豬瘟病毒的豬肉流入食品生產加工領域的風險。而建立一種靈敏度更好、準確性更高、抗干擾能力更強并且能避免假陰性與假陽性的非洲豬瘟病毒檢測方法能更及時地發現潛在風險，既有利于非洲豬瘟疫情“早發現、早報告、早處置”，也有利于降低運輸、屠宰、生產加工等下游環節疫情傳播風險，更有利于有效防范非洲豬瘟豬肉進入食品加工環節。目前運用最廣的ASFV檢測技術是世界動物衛生組織（World Organization for Animal Health，OIE）和聯合國糧食及農業組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations，FAO）推薦的紅細胞吸附試驗（用于病毒分離）、直接免疫熒光試驗、免疫酶組化試驗、夾心酶聯免疫吸附試驗（用于檢測病毒抗原）、聚合酶鏈式反應、qPCR以及環介導等溫擴增技術（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）（用于檢測病毒核酸）。我國針對ASF的實驗室診斷技術分別制定了一個國家標準《非洲豬瘟診斷技術》GB/T 18648-2002[20]、一個商檢行業標準《非洲豬瘟檢疫技術規范》SN/T 1559-2010[21]和一個團體標準《非洲豬瘟病毒實時熒光PCR檢測方法》T/CVMA 5-2018[19]。其中最為常用的檢測技術是qPCR，但該技術無法實現精準定量，在實際工作中可能出現假陰性與假陽性結果，給非洲豬瘟疫情的防疫工作帶來極大的不便。而ddPCR作為一種新的定量檢測技術已廣泛運用到分子生物學檢測中，具有較好的特異性與準確性，理論上可以精確到單個病毒核酸的檢測，能有效避免qPCR檢測所遇到的假陰性、假陽性問題，極大地提高檢測的準確性。原霖等[10]、鄔旭龍等[11]開展了非洲豬瘟病毒的ddPCR相關研究工作，但尚未廣泛推廣應用到ASFV的檢測中，尤其是預包裝食品領域仍未見相關報道。本文根據非洲豬瘟病毒核酸的2段保守序列（VP72和K205基因），合成3對引物和探針，摸索條件，優化方法，并比較方法的線性、特異性、靈敏性和重復性。結果表明，這3種方法的檢出限均小于6拷貝數/反應，在10～106拷貝數/反應之間呈良好的線性關系，定量范圍內的檢測變異系數均低于15%，重復性好，特異性強，能滿足快速定量檢測的要求。在后續工作中，這3種方法將進一步推廣應用到生鮮肉、冷卻肉、腌臘肉、醬鹵肉、油炸肉、火腿、肉干、肉鋪等豬肉制品中，爭取在源頭、食品加工、食品銷售等各個環節中加強生鮮豬肉及各類豬肉制品中非洲豬瘟病毒的檢測，切實降低潛在風險。