1株產鐵載體辣椒內生細菌的分離鑒定及其促生長作用

雷 平，黃 軍，黃彬彬，畢世宇，郭照輝，劉清術，唐 瀅*

（1.湖南省微生物研究院，長沙410009；2.湖南省農用微生物應用工程技術研究中心，長沙410009）

我國是世界第一大辣椒生產國與消費國，年播種面積約133萬公頃[1]。但是在辣椒種植上普遍存在盲目施肥和過度施肥的現象，大量化肥的施用導致土壤板結及肥力下降，最終造成辣椒產量和品質的下降，這一現象已經影響到我國農業的可持續發展[2]。

過量施用化肥會造成肥料利用率低、生態環境惡化等一系列問題。因此，能替代化肥的新型安全高效肥料的研制迫在眉睫。擁有多種促生功能且性能穩定的生物有機肥的研發及應用具有重要的研究意義和廣闊的市場前景[3]。生物有機肥中的菌株來源于土壤或植物材料，對環境無毒無害，施用后可以改良土壤，增加土壤有機質的含量，還可促進作物的生長發育，從而起到提高產量和改善品質的作用[4-5]。

內生菌作為一類未被完全發掘的微生物資源，近年已成為植物促生抗病微生物篩選的熱點。篩選和利用辣椒內生菌來防治植物病害的研究已經有大量報道[6-8]，本課題組前期也分離篩選了大量內生菌資源，主要集中在芽孢桿菌（Bacillus）和鏈霉菌（Streptomyces）2大類[9-10]。關于辣椒內生菌的促生長研究還不太多，特別是假單胞菌（Pseudomonas）作為植物內生菌對辣椒促生長的報道很少。本研究從湖南省辣椒主栽品種興蔬215中分離到1株產鐵載體的內生假單胞菌PEB40，該菌株能在鉻天青（chrome azurol S，CAS）平板上產生較大的噬鐵圈，同時還具備產生吲哚 -3-乙酸（indole-3-acetic acid，IAA）、溶磷、解鉀、固氮等能力，盆栽試驗中亦顯示出很好的促生長效果，其分子生物學分類鑒定及形態特征表明該菌很可能為假單胞菌屬的1個新種。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗材料為2017年湖南省農科院蔬菜所常年種植辣椒的試驗田內采集的辣椒健康植株，其品種為興蔬215。將植株根上的土用力抖落，用無菌剪刀剪下其根系置于冷藏盒中，帶回實驗室后進行根系微生物分離。

常規細菌的分離培養采用LB（Luria-Bertani）和1/10 LB培養基。其液體培養基的成分為：蛋白胨10 g、牛肉浸膏10 g、氯化鈉 3 g、蒸餾水 1 000 mL，pH值為6.5±0.5（25℃）。將LB液體培養基稀釋10倍，并調節pH值至6.5±0.5（25℃）即為1/10 LB液體培養基。在相應液體培養基中加入1.8%～2.3%瓊脂粉即得固體培養基。

本文采用CAS平板檢測細菌產鐵載體的情況，具體配置參考榮良燕等[11]的研究中的方法，稍有調整。首先配置溶液I：60.5 mg CAS溶于50 mL超純水中，與10 mL Fe3+溶液混合，加入到十六烷基三甲基溴化胺（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，HTAB）溶液中。再配溶液II，其組分為：KH2PO40.3 g、NaCl 0.5 g、NH4Cl 1.0 g、瓊脂粉 15 g、呱嗪二乙酸磺酸鈉（Pipes）30.24 g，pH 6.8。20%蔗糖溶液、10%酸水解酪素、1 mmol/L CaCl2和10 mmol/L MgSO4分別單獨滅菌，待冷卻至50℃，按比率混合后傾注至平板上。

1.2 試驗方法

1.2.1 辣椒內生細菌的分離

內生菌的分離參考袁珊珊[12]的方法，并進行了細微的調整。將田間采集的辣椒主根及側根剪下，用自來水洗凈泥沙，放入超凈工作臺中吹干根表水分；然后將根系剪成小段，放入Na2HPO4溶液中進行超聲，進一步去除根系表面的雜質；取出根系依次用無水乙醇、4%次氯酸鈉溶液、硫代硫酸鈉溶液進行表面消毒，消毒后用大量無菌超純水洗去殘留的消毒劑；取最后一次清洗液涂布于無菌LB平板上檢測根系表面消毒是否徹底；將表面消毒徹底的根系置于超凈工作臺中吹干并放入無菌研缽中，加入適量無菌水研磨成漿液，取1、10、50 μL分別涂布于LB和1/10 LB平板上，30℃培養箱中培養3～7 d，挑取單菌落劃線至LB平板上，經過多次劃線分離，最終獲得菌落形態一致的純培養細菌菌落。

1.2.2 根系內生菌產鐵載體能力的測定

采用CAS平板法對細菌的產鐵載體能力進行測定[11]。將上述分離到的辣椒內生菌株接種到LB平板上培養24～36 h后，采用點接種法，用滅菌的牙簽將菌種接在CAS固體檢測平板上，每個菌種3個重復，置于30℃培養箱培養2～7 d。觀察菌落周圍是否產生黃色暈圈，即噬鐵圈，并測定黃色透明圈的直徑。選擇暈圈直徑大小在（5.0±0.5）mm且在LB培養基中菌落呈淺黃綠色、表面光滑、無芽胞、桿狀的革蘭氏陰性細菌進行后續試驗。

1.2.3 內生菌PEB40促進植物生長指標的檢測

為檢測內生菌PEB40除了產生鐵載體之外，是否還具備其他促進植物生長的潛力，我們根據文獻報道的方法[13-14]，對其進行了產IAA、溶解有機磷、無機磷、解鉀及固氮等能力的測定。

1.2.4 內生菌PEB40的16S rDNA序列測定及初步菌種鑒定

根據前期建立的方法[9-10]進行菌種鑒定，具體如下：挑單菌落接種于LB液體培養基中，過夜培養后收集菌液，用無菌水洗滌1次后，取1 μL菌懸液作為模板，用細菌通用的16S rDNA擴增引物27F/1492R擴增待測菌株16S rDNA。菌落PCR擴增體系為：PCR Mix 25 μL、引物 27F（10 μmol/L）1 μL、引物 1492R（10 μmol/L）1 μL、模板 1 μL，加重蒸水至 50 μL。擴增條件為：98 ℃ 10 min，98 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，72 ℃35 s，35個循環；72℃ 10 min。采用DNA膠回收試劑盒，通過瓊脂糖凝膠電泳回收目標DNA片段，送湖南擎科生物技術有限公司測序。測序結果用Ez-BioCloud（https：//www.ezbiocloud.net/）進行在線分析[15]，選取同源性在98.39%至95.35%的假單胞菌屬的模式菌株進行Clustal Omega多序列比對，利用軟件Mega X構建系統進化樹，采用自舉法（Bootstrap）評估分支可信度，Bootstrap取樣值大于1 000。

1.2.5 產鐵載體菌株的促生長田間小區試驗

活化假單胞菌PEB40，并接種于LB液體培養基中，于28℃、150 r/min培養至對數生長期得到種子液。種子液按2%的接種量轉接于新鮮LB液體培養基中，28℃、150 r/min震蕩培養 40～48 h得到發酵液。將發酵液倒出后，通過平板計數的方式計算發酵液中的有效活菌數。菌液離心后棄去上清，用水將發酵液稀釋成菌液濃度為108CFU/mL的溶液，用于辣椒盆栽試驗。盆栽試驗設置2個組，即空白組（check，CK）、處理組（PEB40），每組種植 20株，盆栽土壤采用取自田間的菜地土，每盆裝2 kg。移栽前，處理組的辣椒苗用PEB40菌液浸根處理30 s，而后每10 d對辣椒植株澆灌1次制備的菌劑（菌液濃度為108CFU/mL），菌劑用量為每株10 mL，共澆灌3次；空白組用清水替代菌劑進行浸根處理和辣椒植株的澆灌，處理組和對照組的其他水肥管理條件完全相同，按農民慣用的施肥用量進行施肥，統一不使用防治病害的藥劑。種植50 d后，觀察辣椒的生長情況，記錄株高和展幅等指標，統計辣椒植株從開始結果到有效采收期（50 d）內所有成熟辣椒的鮮重，結果數是采收辣椒的總數量。所有數據均用SPSS 22.0軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 產鐵載體內生菌的分離和篩選結果

本文從辣椒根系樣品中分離到內生細菌52株。將這些菌株分別點接到CAS平板上，其中7株內生菌能產生不同大小的黃色噬鐵圈，分別為PEB5、PEB5、PEB15、PEB21、PEB23、PEB40、PEB73、PEB99，表明這些菌株能產生鐵載體以螯合培養基中的鐵（表1）。本研究對各菌株產生的噬鐵圈大小進行了測定，通過比較噬鐵圈大小發現，PEB40菌株產生的噬鐵圈最大，半徑為（5.0±0.5）mm，如圖 1a所示，因此我們選取該菌株進行后續的促生長試驗。

表1 不同辣椒內生菌產鐵載體能力測定Tab.1 CAS assay for analysis of siderophores produced by different capscium endophytes

2.2 產鐵載體內生菌PEB40的形態學觀測

經革蘭氏染色，PEB40菌體在顯微鏡下呈現紅色，推測其應為革蘭氏陰性菌。同時其菌體呈短桿狀，兩端鈍圓，不形成芽孢（圖1b）。在LB固體培養基上，PEB40菌株形成的菌落呈淡黃色（圖1c）。

2.3 產鐵載體內生菌PEB40促進植物生長潛能的測定

內生菌PEB40產IAA、溶磷、解鉀、固氮等能力測定結果顯示，其除了能產生鐵載體外，還能在添加色氨酸的情況下產生植物生長激素IAA。此外，該菌還能在以有機磷為唯一磷源的測定培養基上產生較大的透明水解圈，說明其具有較強的溶解有機磷的能力。在以無機磷為唯一磷源的培養基上亦能產生水解圈。該菌也可在鉀長石和阿須貝無氮培養基上很好地生長，說明其可能還具有解鉀和固氮能力，詳見表2。因此，內生菌PEB40具有較大的促進植物生長的潛力。

2.4 內生菌PEB40對辣椒的促生長效果

本文采用盆栽試驗測定了PEB40菌株對辣椒的促生長效果。從表3中可看出，處理組的辣椒植株比對照組長勢更茂盛，處理50 d后，辣椒的結果數、產量、株高、展幅與空白組相比，各指標均存在顯著的優勢（P＜0.05），其中株高增加了18.9%，展幅增加了20.7%，產量增加了35.3%。這表明產鐵載體內生菌PEB40對辣椒具有明顯的促生長效果，具有開發為微生物肥料的潛力。

圖1 PEB40菌株Fig.1 Strain PEB40

表2 內生菌PEB40促生指標測定Tab.2 Detection of the plant-promoting ability of endophytic bacteria PEB40

2.5 產鐵載體內生菌PEB40的16S rDNA序列分析及初步鑒定

16S rRNA基因序列同源性為細菌新種鑒定的重要指標之一。微生物分類學界權威人士，EzBio-Cloud創始人、首爾大學教授Chan[16]報道，98.7%為判定新種的分界點。微生物分類學權威雜志International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology（IJSEM）上發表的新種，其最高同源性也在該范圍內[17]。以PEB40的基因組為模板，27F/1492R為引物，成功擴增到了1.5 kb左右的條帶，切膠純化后進行測序，將所得序列提交至GenBank（ID:MT703-863），并與EzBioCloud數據庫中的模式菌株進行比對。比對結果顯示與該菌16S rDNA同源性最高的菌株為硝基還原假單胞菌（Pseudomonas nitroreducensDSM 14399），同源性為98.38%，低于閾值（98.7%）。將該16S rDNA序列與假單胞菌屬（Pseudomonas）的代表菌株進行多序列比對，構建系統發育樹（圖2），從中可看出，PEB40與硝基還原假單胞菌（P.nitroreducens）DSM 14399在進化樹上位于不同分支，分支處Bootstrap值為91，可信度高，且距離較遠，為新種可能性大。菌株、菌落形態特征表明PEB40應為假單胞菌屬的菌株。

表3 內生菌PEB40對辣椒的促生長效果Tab.3 Growth promotion effect of endophyte PEB40 on capscium

圖2 內生菌PEB40的16S rDNA進化樹(鄰位法)Fig.2 Neighbour-joining phylogenetic tree of the endopytic bacterium PEB40 based on its 16S rRNA gene sequence

3 討論

關于辣椒內生菌分離的研究報道較多，主要集中在辣椒病害拮抗菌的篩選上。已報道的辣椒促生長菌株主要為根際促生長菌株（plant growth promoting rhizobacteria，PGPR），而對于從內生菌中篩選促進植物生長的微生物菌株并不多見[6-10]。內生菌具有較強的定植和靶向能力，在施入土壤后，能通過根系進入植物體內實現穩定的定植，并行使相關功能，因此，內生菌相比于土壤及根際微生物而言，將更有優勢[18-20]。本研究從多年種植辣椒的基地采集了健康植株的根系，表面消毒后從根系中分離到1株內生細菌PEB40，該菌株能在CAS平板上產生較大的噬鐵圈，還具有較好的產IAA和溶解有機磷的能力，顯示了很好的植物促生長潛能。盆栽試驗顯示，PEB40菌株對辣椒具有顯著的促生長效果，施用該菌劑后，辣椒的結果數、產量、株高、展幅與空白組相比均存在顯著的優勢（P＜0.05），具有開發為微生物肥料的潛力。經16S rDNA序列及進化樹分析，PEB40很可能是假單菌屬的一個新種，與其同源性最高的菌株為硝基還原假單胞菌（P.nitroreducens）DSM 14399。

鐵在地殼中含量豐富，但中性pH下，可溶性游離鐵離子的濃度僅為10-10～10-9mol/L，遠達不到生物體能利用的濃度（10-7～10-5mol/L）[21]。鐵載體能螯合環境中的鐵離子，將其轉化為生物體可利用的形式。植物能從其自身及其他微生物的鐵載體中獲取鐵離子，有些植物甚至能夠通過分泌酚類物質調節根際微生物群落，使能產生鐵載體的微生物的豐度增加。多篇報道亦表明假單胞菌屬（Pseudomonas）和鏈霉菌屬（Streptomyces）的多株細菌能夠通過產生鐵載體促進植物生長[22-23]。此外，根際細菌產生的鐵載體也可以通過與植物病原菌競爭鐵離子，進而抑制其生長，提高植物的抗病能力[24]。鐵載體還可以螯合許多有害的金屬離子，如 Cr3+、Al3+、Cu2+、Eu3+、Pb2+等，改善土壤理化性質[25]。部分有益根際微生物亦可定植于植物體內成為內生菌。內生菌PEB40具有較強的產鐵載體能力及促生性能，然而其中的機理仍有待進一步研究。接下來，我們將深入研究菌株PEB40對土壤理化性質及根際微生物群落結構的影響，進行生理生化及化學成分分析以完善該菌的新種鑒定工作，繼續開展PEB40菌株的生物安全性評價、高水平發酵工藝以及與其他微生物肥料功能菌株的復配工藝、田間施用技術等，推動將PEB40菌株作為新微生物肥料生產菌株的開發和應用。