工程酵母INVSC1與H1246的生長(zhǎng)與目標(biāo)化合物積累的比較

李 宏，劉萌萌，唐中偉，李友蓮

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太谷030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷030801）

隨著基因組學(xué)和代謝工程技術(shù)的不斷發(fā)展，各種代謝途徑的關(guān)鍵酶基因得到廣泛的研究，相關(guān)的工程酵母也逐漸被大家關(guān)注。酵母與動(dòng)物、植物都為真核生物，具有生長(zhǎng)繁殖較快、代謝周期較短、容易分離和培養(yǎng)等特點(diǎn)，可廣泛應(yīng)用于構(gòu)建真核生物模型，研究相關(guān)目的基因的功能等。釀酒酵母是單細(xì)胞真核微生物，屬于酵母屬（Saccharomyces）釀酒酵母種（Saccharomyces cerevisiae）。工程酵母INVSC1就是釀酒酵母中的一個(gè)重要代表種，又稱釀酒酵母INVSC1（CerevisiaeINVSC1），它生長(zhǎng)繁殖較快，代謝周期較短，發(fā)酵工藝簡(jiǎn)單，成本低廉，容易分離和培養(yǎng)，而且全基因組比較小，遺傳代謝背景比較清楚，具有完整的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和控制嚴(yán)密的基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)機(jī)制，是外源基因[1]表達(dá)最為理想的真核生物表達(dá)系統(tǒng)，由于易于對(duì)其基因組進(jìn)行連鎖分析、分子克隆及序列檢測(cè)等，所以，還可廣泛應(yīng)用于構(gòu)建真核生物模型和繪制更加詳細(xì)而精準(zhǔn)的遺傳譜圖，為人類的遺傳疾病治療和檢測(cè)水平提供強(qiáng)有力的支撐。

油脂是高級(jí)脂肪酸與甘油形成的酯，即三脂酰甘油（TAG）。三脂酰甘油的生物合成途徑主要是甘油-3-磷酸（Gly3P）和脂酰輔酶A（acyl-CoA）為前體并在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)酰基轉(zhuǎn)移酶作用下通過(guò)多步生物反應(yīng)合成的。其最后一步反應(yīng)在二脂酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶（DGAT）作用下形成。三脂酰甘油還可由PDAT途徑合成，即磷脂和二酰甘油在磷脂二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶（PDAT）的作用下反應(yīng)生成TAG和溶血磷脂[2-3]。

H1246是酵母突變體TAG缺陷型的酵母菌株，該菌株中調(diào)控編碼TAG合成的DGA1（編碼DGAT）、LRO1基因（編碼PDAT）以及ARE1和ARE2基因（編碼膽固醇脂的合成）均已被敲除，可用于鑒定植物、動(dòng)物和微藻等真核生物三脂酰甘油（TAG）合成途徑中DGAT或PDAT的活性[4-5]。三脂酰甘油（TAG）可以由DGAT和PDAT途徑合成[6]，由于H1246是TAG缺陷型酵母菌株，因而，不能通過(guò)上述途徑合成和積累TAG。而工程酵母INVSC1是正常型的酵母菌株，可以合成和積累TAG，用來(lái)驗(yàn)證相關(guān)目的基因的功能等。

近年來(lái)，在工程酵母的研究與應(yīng)用方面取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展。如趙偉軍[7]利用代謝工程技術(shù)對(duì)工業(yè)釀酒酵母菌株合成S-腺苷蛋氨酸（SAM）的代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行優(yōu)化和改造，大幅度提高了該工業(yè)菌株生產(chǎn)SAM的能力；傅盈盈等[8]以油菜菌核病原菌為試驗(yàn)病菌，工程酵母INVSC1在溫度28℃條件下培養(yǎng)繁殖20 h后，經(jīng)測(cè)定，當(dāng)接種量為5% 時(shí)，INVSC1對(duì)油菜菌核病原菌的抑菌效果最好；李媛等[9]通過(guò)對(duì)釀酒酵母基因工程菌的構(gòu)建和工藝優(yōu)化的研究以及加強(qiáng)對(duì)細(xì)胞代謝工程、基因組學(xué)、蛋白組學(xué)的商討，從而獲取了更多酵母的相關(guān)基因信息；王珍[10]通過(guò)對(duì)圓紅冬孢酵母細(xì)胞內(nèi)的DGAT基因進(jìn)行鑒定和功能性分析，確定了產(chǎn)油酵母圓紅冬孢酵母中只有RtDGATb具有DGAT的活性，并和油脂積累相關(guān)聯(lián)，是調(diào)控油脂積累過(guò)程中的關(guān)鍵因素。這些成果為工程酵母各個(gè)方面的研究奠定了基礎(chǔ)。

本研究以工程酵母INVSC1和H1246為研究材料，通過(guò)培養(yǎng)并測(cè)定INVSC1與H1246的生長(zhǎng)曲線，經(jīng)尼羅紅染色、蘇丹黑染色、總脂肪酸含量測(cè)定、脂肪酸分析及薄層色譜分析等研究，分析工程酵母INVSC1與H1246的生長(zhǎng)狀況及目標(biāo)化合物積累情況，旨在為后期油脂代謝相關(guān)基因功能驗(yàn)證等分子生物學(xué)試驗(yàn)提供基礎(chǔ)，同時(shí)為酵母互補(bǔ)試驗(yàn)提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試工程酵母INVSC1和H1246由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 生長(zhǎng)趨勢(shì)測(cè)定

1.2.1.1 培養(yǎng)基的配制及接種 分別稱取4 g酵母膏、8 g蛋白胨、8 g無(wú)水葡萄糖于1 000 mL容量瓶中，向容量瓶中加入400 mL蒸餾水，振蕩使其混合均勻制備為YPD液體培養(yǎng)基。將液體培養(yǎng)基于滅菌鍋高溫（120℃）高壓（33.78 kPa）中滅菌20 min。在已滅菌的YPD液體培養(yǎng)基中分別接入20μL工程酵母INVSC1和H1246菌種。

1.2.1.2 菌液濃度的測(cè)定 將接完菌的液體培養(yǎng)基于溫度30℃、轉(zhuǎn)速180 r/min的空氣浴振蕩器中振蕩，每2 h用移液槍分別吸取工程酵母INVSC1和H1246的培養(yǎng)基液體3 mL于2個(gè)比色皿中，以未接種酵母的YPD液體培養(yǎng)基作為對(duì)照，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)量其吸光度[11]并記錄數(shù)據(jù)。

1.2.2 工程酵母INVSC1和H1246菌株的尼羅紅染色[12]觀察 將INVSC1與H1246的菌液離心并將二者菌株匯集起來(lái)，蒸餾水洗滌二者的沉淀，稀釋菌體沉淀，將菌液OD600調(diào)整至0.2～0.3（菌液濃度過(guò)高影響染色效果）。分別向菌液中依次加入菌液100μL、蒸餾水850μL、二甲基亞砜（DMSO）50μL、尼羅紅染液（5 mg/mL）10μL，強(qiáng)烈振蕩混合均勻5 s，避光染色1 min，用熒光相差顯微鏡觀察藍(lán)色激發(fā)光下酵母的染色情況，并記錄結(jié)果。

1.2.3 酵母中性油脂的檢測(cè) 將INVSC1與H1246的菌液離心并將二者菌株收集起來(lái)，然后用蒸餾水洗滌二者的沉淀，并將菌體沉淀稀釋，將菌液OD600調(diào)整至0.4～0.5。用無(wú)菌水重懸菌體沉淀，混合均勻后5 000 r/min離心5 min，倒掉上清液，分別向INVSC1與H1246的離心管中加入3 mL 0.3% 的蘇丹黑[13-14]染液，染色15 min后于8 000 r/min下離心3 min后去掉上清液，分別向離心管中加入10 mL 70% 的酒精溶液混合均勻后離心去掉上清液，重復(fù)3次。用無(wú)菌水重懸菌體沉淀測(cè)OD580值，并記錄數(shù)據(jù)。

1.2.4 工程酵母INVSC1和H1246目標(biāo)化合物的提取與分析

1.2.4.1 總脂肪酸的提取 分別稱取50 mg充分研磨的工程酵母INVSC1與H1246酵母粉末于50 mL離心管中，加入7.5 mL的氯仿-甲醇（體積比為1∶2）混合溶劑，將離心管置于溫度37℃、轉(zhuǎn)速200 r/min的空氣浴振蕩器中抽提24 h。離心后收集上層有機(jī)相，向剩余的樣品殘?jiān)偌尤?.5 mL的氯仿-甲醇（體積比為1∶2）混合溶劑重復(fù)抽提12 h，并離心收集上層有機(jī)相，抽提3次并合并有機(jī)相。向收集上層有機(jī)相的離心管中加入5 mL氯仿溶液，9 mL 1% 的氯化鈉溶液，混合均勻后8 000 r/min離心10 min，收集下層有機(jī)相到已經(jīng)稱質(zhì)量的指形管中，水浴鍋加熱至有機(jī)相揮發(fā)并用烘箱烘干，冷卻至室溫后稱取指形管質(zhì)量，計(jì)算脂肪酸總量[15-17]。每組3次重復(fù)。

總脂肪酸含量＝（提取后總質(zhì)量－提取前管質(zhì)量）/酵母菌粉質(zhì)量 （1）

1.2.4.2 酵母脂肪酸成分分析 通過(guò)高速冷凍離心機(jī)將工程酵母INVSC1與H1246酵母冷凍24 h即可得到二者的干燥菌體。用分析天平分別稱取100 mg工程酵母INVSC1與H1246的干燥菌體并用液氮將其研磨成粉末，之后向工程酵母INVSC1與H1246中分別加入1.5 mL提取buffer（含2.5% 濃硫酸的甲醇，V/V），并且用水浴鍋80℃溫浴2 h，待二者冷卻至室溫后分別向其中加入2 mL 0.9% （V/V）氯化鈉和1 mL正己烷，輕輕振蕩混合均勻后在室溫條件下4 000 r/min離心10 min。取二者上清液并真空抽干，將沉淀用50μL乙酸乙酯溶解。在提取過(guò)程中加10μL C17∶0內(nèi)標(biāo)。

通過(guò)GC System測(cè)定工程酵母INVSC1與H1246酵母的脂肪酸含量。色譜柱采用BPX-70柱，毛細(xì)柱采用30 mm×0.25 mm，設(shè)定GC的升溫程序：初始溫度設(shè)定為120℃并保持1 min，色譜柱的溫度以10℃/min的速率上升至150℃，然后再以4℃/min的速率讓色譜柱溫度上升至230℃并保持10 min。分別取其1μL樣品上樣后檢測(cè)其脂肪酸含量[18]。每組3次重復(fù)。

1.2.5 薄層色譜分析（TLC） 在硅膠板的下端1.5 cm處用毛細(xì)管依次均勻點(diǎn)上TAG標(biāo)樣、工程酵母INVSC1和H1246總脂肪酸，點(diǎn)樣斑點(diǎn)直徑不大于0.5 cm，每樣間隔2.5 cm，待斑點(diǎn)溶劑揮發(fā)干后將硅膠板放入展開(kāi)劑（按照正己烷∶乙醚∶甲酸＝40∶1∶1（體積比））飽和的層析缸中進(jìn)行展開(kāi)。當(dāng)上行展開(kāi)溶劑前沿距硅膠板上端約2 cm處時(shí)，將硅膠板取出并晾干[19]。等展開(kāi)劑揮發(fā)后，將硅膠板放置于染色碘缸中進(jìn)行染色，確定斑點(diǎn)位置。每組3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌液濃度的測(cè)定結(jié)果

微生物生長(zhǎng)曲線一般包括遲緩期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期3個(gè)階段。從圖1可以看出，工程酵母INVSC1與H1246的生長(zhǎng)時(shí)期有著明顯的區(qū)別，INVSC1在0～8 h處于遲緩期，8～18 h處于對(duì)數(shù)期，18～28 h處于穩(wěn)定期；H1246在0～12 h處于遲緩期，12～22 h處于對(duì)數(shù)期，22～28 h處于穩(wěn)定期。由此可知，在相同的生長(zhǎng)條件下，工程酵母INVSC1比H1246生長(zhǎng)快，先進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和穩(wěn)定期。此外，從圖1還可以看出，工程酵母生長(zhǎng)的每個(gè)階段有不同的特點(diǎn)，遲緩期測(cè)定的濃度與剛開(kāi)始時(shí)測(cè)定濃度一樣；對(duì)數(shù)期菌的生長(zhǎng)速度大大加快，單位時(shí)間內(nèi)菌液的濃度增加量保持一致并達(dá)到最大值；穩(wěn)定期測(cè)定的菌液濃度增加量最小，基本上為0。

2.2 工程酵母INVSC1和H1246菌株的尼羅紅染色觀察結(jié)果

從圖2可以看出，通過(guò)明場(chǎng)和熒光場(chǎng)的比較，工程酵母INVSC1經(jīng)過(guò)尼羅紅染色細(xì)胞呈橘紅色，內(nèi)部有明亮的油滴，因?yàn)槟崃_紅會(huì)與中性油脂發(fā)生結(jié)合，并且在藍(lán)色激發(fā)光下發(fā)出熒光。而H1246經(jīng)過(guò)尼羅紅染色后細(xì)胞也呈橘紅色，但是內(nèi)部未見(jiàn)到油滴。

2.3 酵母中性油脂的檢測(cè)結(jié)果

經(jīng)蘇丹黑染色后工程酵母INVSC1與H1246中性油脂被染成了黑色，蘇丹黑附著在油脂上，故吸光度會(huì)提高。將2種酵母的初始懸浮液OD值都調(diào)至0.4左右，染色后，工程酵母INVSC1的OD580值明顯比H1246高，工程酵母INVSC1的OD580值在0.9左右，而H1246的OD580值在0.65左右（圖3）。

2.4 總脂肪酸的測(cè)定結(jié)果

2.4.1 脂肪酸的提取結(jié)果 由圖4可知，工程酵母INVSC1的總脂肪酸含量明顯比H1246的高，工程酵母INVSC1的總脂肪酸含量大約在20% 左右，而H1246的總脂肪酸含量大約在10% 左右。

2.4.2 酵母脂肪酸各成分分析 從圖5、6可以看出，工程酵母INVSC1含有3種不同的脂肪酸，H1246則含有2種不同的脂肪酸，而它們的目的峰分離效果較為明顯，基線也比較平穩(wěn)，沒(méi)有重疊和拖尾等現(xiàn)象，能夠準(zhǔn)確判斷脂肪酸的類型及其相對(duì)含量，它們的出峰時(shí)間依次為C16∶0（棕櫚酸）、C16∶1（棕櫚油酸）、C18∶1（油酸）、C18∶2（亞油酸），每種脂肪酸所對(duì)應(yīng)的峰面積越大，相對(duì)濃度越高，含量就越高[20]。

由表1和圖7可知，工程酵母INVSC1中棕櫚酸和油酸相對(duì)含量較高，而棕櫚油酸的相對(duì)含量非常低，幾乎沒(méi)有，所以，INVSC1中脂肪酸的主要成分是棕櫚酸（C16∶0）和油酸（C18∶1），而H1246中棕櫚酸（C16∶0）和亞油酸（C18∶2）的含量很少，幾乎沒(méi)有。

表1酵母脂肪酸組分分析

2.5 薄層色譜分析（TLC）測(cè)定結(jié)果

由圖8可知，工程酵母INVSC1在硅膠板上有明顯的TAG，而H1246則沒(méi)有，即酵母INVSC1能正常合成積累TAG，而H1246則不能。

3 結(jié)論與討論

本研究通過(guò)培養(yǎng)工程酵母并測(cè)定其生長(zhǎng)曲線，經(jīng)尼羅紅染色、蘇丹黑染色、總脂肪酸含量測(cè)定、酵母脂肪酸成分分析以及薄層色譜分析等一系列試驗(yàn)，結(jié)果表明，在相同的生長(zhǎng)條件下，工程酵母INVSC1合成的油脂多，H1246基本上不合成油脂，可以比較出正常酵母和缺陷酵母合成和積累油脂的能力，即正常酵母比缺陷酵母產(chǎn)油脂能力強(qiáng)，從而為后期油脂代謝相關(guān)基因功能驗(yàn)證等分子生物學(xué)試驗(yàn)提供研究材料和研究基礎(chǔ)。陽(yáng)天泉等[3-4]在研究小桐子磷脂二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶時(shí)，通過(guò)工程酵母的互補(bǔ)試驗(yàn)得出，INVSC1能合成積累TAG，而H1246不能，且他在研究煙草二脂酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶基因時(shí)，通過(guò)TLC層析試驗(yàn)、尼羅紅染色、酵母油脂含量試驗(yàn)也得出了這個(gè)結(jié)論。譚太龍等[18]通過(guò)薄層色譜分析試驗(yàn)研究得出，INVSC1能合成積累TAG，而H1246則不能。本試驗(yàn)所獲得結(jié)果和前人的研究結(jié)果是一致的。

本研究還表明，工程酵母INVSC1與H1246的脂肪酸成分及含量也各不相同，可以提取不同的脂肪酸應(yīng)用于分子生物學(xué)試驗(yàn)、醫(yī)療保健、農(nóng)藥含量檢測(cè)等方面，為工程酵母INVSC1與H1246的進(jìn)一步研究奠定研究基礎(chǔ)。