基質(zhì)金屬蛋白酶基因多態(tài)性與涎腺腺樣囊性癌患者預(yù)后的相關(guān)性研究

王錦鋒，李曉琰，任鵬飛，張晨，李斌，張媛，秦紅霞#

1鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院口腔預(yù)防科，鄭州450000

2鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院（鄭州兒童醫(yī)院）口腔科，鄭州450018

3鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院分子病理科，鄭州450008

涎腺腺樣囊性癌（salivary adenoid cystic carcinoma，SACC）是對人體危害最大的頭頸部惡性腫瘤之一，約占涎腺惡性腫瘤的40%，其兩大特性是局部的高復(fù)發(fā)率及肺、骨、肝等部位的高轉(zhuǎn)移率[1]。腺樣囊性癌短期預(yù)后較好，但遠期生存率顯著降低，尤其肺轉(zhuǎn)移是主要致死病因之一。因SACC復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移缺乏有效的生物標志物，難以判定其預(yù)后，故尋找一種有效的標志物不僅能判定其預(yù)后，還有可能提供新的治療方案。惡性腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移是一個多因素、多步驟、多基因參與的復(fù)雜過程，也是惡性腫瘤患者的主要致死原因。研究表明，基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）是一組與惡性腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移相關(guān)的重要調(diào)節(jié)蛋白。目前已發(fā)現(xiàn)20余種MMP，在口腔癌浸潤和轉(zhuǎn)移中，關(guān)于MMP的研究仍較少，其中MMP2、MMP9已有少量報道[2-3]，且多為其表達水平與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系的研究。單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）是基因組中重要的遺傳變異形式，以往已有大量研究發(fā)現(xiàn)致癌基因或抑癌基因SNP與腫瘤發(fā)病及預(yù)后存在密切關(guān)系[4-5]。目前，MMP2和MMP9基因遺傳變異是否影響SACC患者預(yù)后的研究尚未見報道。基于此，本研究結(jié)合生物信息學(xué)預(yù)測及高通量遺傳變異基因分型技術(shù)，探討MMP2和MMP9基因SNP與SACC患者預(yù)后的相關(guān)性，以期尋找可以指導(dǎo)SACC患者預(yù)后的新型分子標志物。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2009年1月至2015年1月鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的92例SACC患者。納入標準：①初治患者且均行手術(shù)治療；②經(jīng)組織病理學(xué)檢查確診為SACC，病理切片由兩位獨立的病理科醫(yī)師重新評估；③腫瘤起源于大涎腺、小涎腺。排除標準：術(shù)前接受放療、化療及免疫治療等其他治療。92例SACC患者中，男41例，女51例；年齡21～76歲，中位年齡51歲；根據(jù)第7版美國癌癥聯(lián)合委員會（American Joint Committee on Cancer，AJCC）分期標準進行臨床分期：I期12例（13.0%），Ⅱ期22例（23.9%），Ⅲ期 26例（28.3%），Ⅳ期 32例（34.8%）；參照Szanto標準[6]將病理類型分為3級：I級37例（40.2%），Ⅱ級30例（32.6%），Ⅲ級25例（27.2%）；有神經(jīng)侵犯54例（58.7%）。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，所有患者均對本研究知情并簽署知情同意書。

1.2 檢測方法

1.2.1 血液樣本DNA提取采集每位患者約4 ml空腹靜脈血到含有乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）的抗凝管中。分離血漿后，血細胞用全血基因組小量抽提試劑盒（購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司）提取DNA，操作步驟按照試劑盒說明書進行，定量后標記置于-80℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 目標SNP選擇及基因分型通過NIH SNP Function Prediction數(shù)據(jù)庫（https://snpinfo.niehs.nih.gov/snpinfo/snpfunc.html）篩選MMP基因家族代表性基因MMP2和MMP9，包含上下游2000 bp區(qū)域所有潛在影響基因表達的SNP。選擇標準：①中國人群中次等位基因型頻率＞0.05及候選位點連鎖不平衡相關(guān)程度＜0.8；②位點位于基因外顯子、5'非翻譯區(qū)、啟動子區(qū)及3'非翻譯區(qū)。然后利用Sequenom Mass Array高通量技術(shù)平臺進行基因分型檢測。SNP基因型分組采用顯性模型，即野生基因型vs突變基因型（雜合突變+純合突變）。

1.3 隨訪

自手術(shù)日開始，定期記錄患者病情變化，隨訪至患者死亡或隨訪截止日期（2018年2月），其中失訪3例，失訪按刪失數(shù)據(jù)計算。生存時間定義為手術(shù)日期至死亡或隨訪截止日期。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料以例數(shù)及率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，生存情況的比較采用Log-rank檢驗；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同臨床特征的SACC患者死亡情況的比較

臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、有周圍神經(jīng)侵犯的SACC患者死亡率分別明顯高于臨床分期為I～Ⅱ期、無周圍神經(jīng)侵犯的SACC患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；不同年齡、性別和病理分級患者的死亡率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（表1）

表1 不同臨床特征的SACC患者死亡情況的比較（n=92）

2.2 MMP基因SNP在SACC中的分布

利用NIH功能性SNP預(yù)測數(shù)據(jù)庫篩選了MMP2基因中3個SNP（rs243832、rs7201、rs243831）和MMP9基因中 2個 SNP（rs3918249、rs3918241）進行基因分型檢測。其中4個SNP位點可能影響轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，1個SNP位點可能影響miRNA結(jié)合（表2）。對92例患者進行基因分型后，計算每個SNP位點等位基因型頻率，與表2中中國人群優(yōu)勢等位基因型頻率相比無顯著差異。

表2 MMP基因SNP檢測位點

根據(jù)每個SNP位點野生基因型和突變基因型將患者分組，分析不同MMP基因SNP位點患者死亡情況是否存在差異。MMP2基因rs243832野生型（GG）患者死亡率高于突變型（GC+CC）患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。其他不同SNP位點患者死亡率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（表3）

表3 不同MMP基因SNP位點患者死亡情況的比較（n=92）

2.3 不同rs243832基因型患者的生存情況

rs243832位點40例GG基因型患者中位生存時間為69.1個月，短于52例GC+CC基因型患者的94.8個月，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=6.544，P=0.011）。（圖1）

圖1 rs243832位點GG基因型（n=40）與GC+CC基因型（n=52）患者的生存曲線

3 討論

SACC是頜面外科最常見的惡性腫瘤之一，易沿神經(jīng)擴散，浸潤性極強，易造成遠處轉(zhuǎn)移。雖然隨著治療手段的進步，患者的生存率有所提高，但轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)仍然是其死亡的主要原因。以往關(guān)于SACC臨床預(yù)后研究常集中在致癌基因或抑癌基因在患者組織中表達水平與疾病進展的關(guān)系方面[7-8]。雖然取得了一定進展，但尚未應(yīng)用于臨床。由于腫瘤組織存在瘤內(nèi)異質(zhì)性，組織樣本的取材位置不同極有可能造成不同的檢測結(jié)果，因此尋找基于血液樣本的新型標志物將有助于更好地評估SACC患者預(yù)后，指導(dǎo)臨床精準治療[9]。

MMP又稱間質(zhì)蛋白酶，在降解細胞外基質(zhì)和基膜、促進腫瘤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要功能，同時還具有原發(fā)和繼發(fā)腫瘤的生長調(diào)節(jié)效應(yīng)、調(diào)節(jié)細胞黏附及促進新生血管形成等功能。目前已知的MMP至少有25種，其中MMP2和MMP9研究最為廣泛，是降解Ⅳ型膠原最主要的酶，在腫瘤的血管化、腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移灶形成中發(fā)揮重要作用。已有大量研究表明MMP2和MMP9表達水平與腫瘤預(yù)后密切相關(guān)，包括腎癌[10]、膠質(zhì)瘤[11]、食管癌[12]等多種常見腫瘤。而MMP與SACC的研究較少，Wang等[13]研究發(fā)現(xiàn)相比于正常人群，MMP2更容易在SACC患者組織中表達，提示MMP2在SACC發(fā)生及進展中發(fā)揮一定作用。另一項研究同樣發(fā)現(xiàn)SACC患者組織中MMP2表達明顯升高，并且有潛在的預(yù)測患者預(yù)后的價值[14]。本研究中發(fā)現(xiàn)MMP2基因rs243832不同基因型患者中位生存時間存在差異（69.1個月vs94.8個月），而生物信息學(xué)預(yù)測rs243832位點不同基因型可影響多個重要轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，從而可能影響MMP2基因表達，最終參與SACC惡性進展，然而具體分子機制仍需進一步功能驗證。在另一項關(guān)于MMP2基因SNP與鼻咽癌的發(fā)病風(fēng)險研究中，同樣未發(fā)現(xiàn)MMP2基因rs7201位點與腫瘤發(fā)生及進展存在相關(guān)性[15]。而MMP9基因rs3918249位點與子宮內(nèi)膜癌發(fā)病風(fēng)險顯著相關(guān)[16]，但在本研究中未發(fā)現(xiàn)其與SACC預(yù)后存在顯著相關(guān)性。因此，基于更大樣本量以及覆蓋更多SNP位點的SACC預(yù)后研究有待進一步開展。

已有大量研究發(fā)現(xiàn)SNP與多種腫瘤發(fā)病及預(yù)后存在密切關(guān)系[17]。然而目前SNP與SACC的臨床相關(guān)性研究仍未見報道，因此尋找并鑒定可以評估SACC患者預(yù)后的SNP位點，建立SACC預(yù)后診斷標志物，對于臨床指導(dǎo)具有重要意義。