帕羅西汀片對抑郁癥大鼠模型抑郁行為的改善效果及相關作用機制分析

劉新黎 陳家俊 胡浩宇 金崗生 徐賓 戴煒鵬 胡婭娜 馮炯 陳衍 謝青瀟

[摘要] 目的 分析帕羅西汀片對改善抑郁癥大鼠模型抑郁行為的效果，同時對相關作用機制進行探討。 方法 選取健康雄性SD大鼠63只，并隨機分為參照組（n=21）、試驗組（n=21）及模型組（n=21）。正常飼養參照組大鼠，試驗組大鼠及模型組大鼠在孤養及慢性輕度不可預見刺激條件下進行抑郁癥大鼠模型構建，模型建立期間對試驗組大鼠實施帕羅西汀灌胃操作，對模型組及參照組大鼠實施0.9% NaCl灌胃操作，分析帕羅西汀片對抑郁癥大鼠自主活動次數、不動時間、記憶能力及學習能力大鼠海馬CA3區TrkB、BDNF蛋白表達產生的影響。 結果 試驗組大鼠自主活動次數明顯較模型組多，試驗組及模型組大鼠自主活動次數均明顯少于參照組大鼠，差異有統計學意義（P<0.05）。Morris水迷宮定位航行實驗結果顯示，試驗組大鼠潛伏期第1～4天均明顯短于模型組，試驗組、模型組Morris水迷宮空間探索實驗穿臺次數明顯多于參照組，差異有統計學意義（P<0.05）。免疫組化染色結果表明大鼠海馬CA3區BDNF蛋白陽性著色為棕褐色，TrkB著色亦為棕褐色，與參照組及試驗組相比，模型組陽性著色明顯減少且染色強度明顯下降。模型組大鼠TrkB及BDNF蛋白陽性細胞占比均顯著低于參照組及試驗組（P<0.05）;試驗組大鼠TrkB及BDNF蛋白陽性細胞占比較參照組低，差異有統計學意義（P<0.05）。 結論 帕羅西汀片能夠使抑郁癥大鼠抑郁癥狀得到明顯改善，同時還能使大鼠記憶能力以及學習能力得到提高，作用機制與海馬CA3區TrkB及BDNF蛋白表達獲得上調存在一定的相關性。

[關鍵詞] 帕羅西汀片;抑郁癥大鼠模型;抑郁行為;改善效果;作用機制

[中圖分類號] R971? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2020）19-0033-04

Ameliorative efficacy of paroxetine tablets against depressive behavior in depression rat models and the mechanism behind it

LIU Xinli? ?CHEN Jiajun? ?HU Haoyu? ?JIN Gangsheng? ?XU Bin? ?DAI Weipeng? ?HU Ya'na? ?FENG Jiong

CHEN Yan? ?XIE Qingxiao

Department of Encephalopathy （Neurology）， Jinhua Hospital of Traditional Chinese Medicine in Zhejiang Province， Jinhua? ?321017， China

[Abstract] Objective To analyze the ameliorative effects of paroxetine tablets on depressive behavior in depression rat models and explore the relevant mechanism. Methods Sixty-three healthy male Sprague-Dawley（SD） rats were randomly divided into the control group（n=21）， the test group（n=21） and the model group（n=21）. Rats in the control group were normally housed， and those in the test and model groups were housed individually under chronic unpredictable mild stress（CUMS） to establish depression rat models. Rats in the test group were intragastrically administered with paroxetine during the establishment of the depression model， and those in the control and model groups were merely intragastrically administered with 0.9% NaCl. Effects of paroxetine on locomotor activity， freezing time， memory and learning ability， and the protein expressions of brain-derived neurotrophic factor（BDNF） and its receptor TrkB in the CA3 hippocampus in depression rats were analyzed. Results The locomotor activity significantly increased in the test group compared with the model group， and it significantly decreased in the test and model groups compared with the control group， with statistically significant differences（P<0.05）.In the Morris water maze（MMM） trials， the test group showed a shorter latency than the model group from Day 1 to Day 4. The test and model groups presented more platform-crossing numbers than the control group， with statistically significant differences（P<0.05）. Immumohistochemical staining showed that BDNF-positive neurons （brown） and TrkB-positive neurons （brown） in the CA3 region significantly decreased with lower staining intensity in the model group compared with the control and test groups. Proportions of both TrkB- and BDNF-positive neurons in the model group were lower that those in the control and test groups（P<0.05）. Proportions of TrkB-and BDNF-positive neurons in the test group were lower than those in the control group， with statistically significant differences（P<0.05）. Conclusion Paroxetine tablets significantly improved depressive behavior in depression rats with enhanced memory and learning ability. This effect perhaps associated with the up-regulations of TrkB and BDNF in the CA3 hippocampus.

[Key words] Paroxetine tablets; Depression rat model; Depressive behavior; Ameliorative efficacy; Mechanism

近年來由于人們生活及工作壓力不斷加大，抑郁癥發病率不斷升高，對廣大患者的正常生活造成干擾，部分病情嚴重患者容易出現自殘及自殺傾向，生命安全受到極大的威脅[1-2]。帕羅西汀片屬于臨床應用較廣的一線抗抑郁藥物，該藥物為選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑，對于改善患者抑郁情緒能夠發揮一定的作用[3]。建立理想的實驗動物模型能夠為臨床深入研究和探析抑郁癥機制并為臨床用藥提供重要參考。評價情感障礙類實驗動物模型是否成功需要自臨床癥狀、致病原因、生理與病理改變和藥品反應靈敏性等方面進行評價，同時還能夠為臨床評價藥物效果及作用提供實驗基礎。此次研究旨在探討帕羅西汀片對改善抑郁癥大鼠模型抑郁行為的效果以及相關作用機制，研究時間為2018年10～12月，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 實驗動物

選取健康雄性SD大鼠63只，體重為200～230 g，周齡均為8～10周，平均（8.57±0.21）周，實驗大鼠動物許可證號：SCKK（粵）2018-0002，購于廣東省醫學實驗中心，動物于無特定病原菌（SPF）環境飼養，每籠4～5只、濕度50%～60%、溫度為22℃～25℃，可自由獲取飲水以及食物，純合子交配繁殖。此次研究獲得動物管理和使用委員會批準，于動物達到試驗環境后對其生長活動情況進行密切觀察。

1.2 儀器試劑

本研究所用鹽酸帕羅西汀片產自北京萬生藥業有限責任公司，國藥準字：H20133084，產品編號：A14202576983。酪氨酸激酶受體B（TrkB）及腦源性神經營養因子（BDNF）購自英國Abcam公司。所用儀器包括CX光學顯微鏡、大鼠Morris水迷宮以及Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件、ZH-LUO/80小鼠自主活動儀。

1.3 分組及用藥方法

選取健康雄性SD大鼠63只并實施隨機分組，主要包括參照組（n=21）、試驗組（n=21）及模型組（n=21）。正常飼養參照組大鼠，試驗組大鼠及模型組大鼠在孤養及慢性輕度不可預見刺激條件下進行抑郁癥大鼠模型構建，連續3周對大鼠進行如下應激：禁水、進食、放置碎布片等陌生異常物品;散發陌生異常氣味;合籠飼養;傾斜籠子（45°）;照明過夜;間歇給予85 dB噪音;潮濕墊料;閃光刺激。每日選擇1～2種刺激且避免同種刺激連續出現。模型建立期間，對試驗組大鼠實施帕羅西汀灌胃操作，將帕羅西汀片與純水混合后實施灌胃操作，帕羅西汀片應用劑量為1.8 mg/kg，純水應用量為1 mL/100 g，灌注頻率4次/d，連續灌胃3周。對模型組及參照組大鼠實施0.9% NaCl灌胃操作，灌注量為1 mL/100 g，4次/d，連續灌胃3周。模型組大鼠存在明顯的抑郁癥狀，主要包括毛色晦暗、興趣減退、食欲不振、體重減輕、探索行為減少等。通過指標檢測以及行為學檢測等模型組大鼠表現出精神運動性抑制、興趣減退以及快感缺失等與人類抑郁癥患者常見行為相似的特征及皮毛光澤暗淡等現象且上述行為持續時間較長，表明抑郁癥大鼠模型造模成功，能夠作為抑郁癥模型進行相關研究[4]。

1.4 檢測大鼠抑郁行為變化情況

結束用藥后應用Open-field實驗對大鼠抑郁行為變化情況進行檢測，場地底部為黑色且環境安靜，于每天相同時間段內開展試驗，提小鼠尾巴將之放入中心方格，觀察4 min內大鼠垂直豎立次數及水平運動格數并進行準確記錄，自主活動次數=垂直得分+水平得分，同時記錄大鼠不動時間[5]。

1.5 檢測大鼠記憶功能及學習功能

干預結束后應用Morris水迷宮測試系統[6]對大鼠記憶功能及學習功能進行檢測，分別對三組大鼠進行空間探索實驗及定位航行實驗。水迷宮為高50 cm、直徑170 cm圓形水池，內置安全島平臺，高度為29 cm、直徑12 cm，進行實驗前小鼠需提前適應環境，游泳訓練后60 s內找到平臺，訓練成功后于造模前后進行測試，持續測試4 d并記錄大鼠找到平臺時間。

1.6 檢測大鼠海馬CA3區TrkB、BDNF蛋白表達情況

完成Morris水迷宮測試后應用Wsetern-blot方法進行TrkB、BDNF蛋白檢測，將500 μL裂解液加入收集好細胞的EP管中，應用超聲勻漿機進行勻漿操作，然后于4℃冰箱內放置一夜，通過電轉移方式轉移至硝酸纖維素膜上，然后加入1：300稀釋兔抗人p-TrkB及TrkB多克隆抗體，于4℃條件下孵育過夜。將1：2000稀釋羊抗兔堿性磷酸酶標記二抗加入，于室溫下孵育下持續孵育2 h，將膜取出并加入堿性磷酸酶顯色劑，于10～30 min后進行蛋白表達檢測，應用分析軟件計算海馬區CA3區TrkB、BDNF蛋白陽性細胞所占百分比[7]。

1.7 統計學處理

應用SPSS21.0統計學軟件包進行統計學分析，計量資料以（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間計量資料比較采用方差分析，計數資料用百分率（%）表示，采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 帕羅西汀片對抑郁癥大鼠自主活動次數、不動時間產生的影響比較

試驗組大鼠自主活動次數明顯多于模型組（P<0.05），試驗組及模型組大鼠自主活動次數均明顯少于參照組大鼠（P<0.05）。模型組大鼠不動時間明顯較參照組及試驗組長（P<0.05），試驗組大鼠不動時間明顯長于參照組大鼠（P<0.05）。見表1。

2.2 三組大鼠潛伏期及穿臺次數比較

Morris水迷宮定位航行實驗結果顯示，模型組大鼠潛伏期第1～4天均明顯長于參照組（P<0.05），試驗組大鼠均明顯短于模型組（P<0.05）。模型組Morris水迷宮空間探索實驗穿臺次數明顯少于參照組（P<0.05），試驗組穿臺次數明顯多于參照組（P<0.05）。見表2。

2.3 帕羅西汀片對抑郁癥大鼠海馬CA3區TrkB、BDNF蛋白表達產生的影響分析

采用免疫組化染色觀察大鼠海馬CA3區TrkB、BDNF蛋白表達情況，光學顯微鏡下進行觀察并采用Image-Pro Plus 多功能真彩色細胞圖像分析管理系統分析圖像數據，研究結果表明大鼠海馬CA3區BDNF蛋白陽性著色為棕褐色，TrkB著色亦為棕褐色，與參照組及試驗組相比，模型組陽性著色明顯減少且染色強度明顯下降，見封三圖4。模型組大鼠TrkB及BDNF蛋白陽性細胞占比均顯著低于參照組及試驗組（P<0.05）;試驗組大鼠TrkB及BDNF蛋白陽性細胞占比較參照組低（P<0.05）。見表3。

3 討論

抑郁癥屬于臨床發病率較高的精神心理疾病，對人類身心健康造成極大的損害，臨床癥狀主要表現為行為遲緩、表情呆滯、記憶力衰退、失眠、心悸、頭暈、精神不振、情緒不寧等，可表現出面色晦暗、脫發、食量異常、體重下降等軀體癥狀以及喜怒無常、易怒急躁等精神癥狀，具有病情復發率高、致殘率高以及自殺率高等特點[8-9]。患者容易伴發躁狂癥狀且出現雙向障礙的可能性較高，一旦患病會導致患者付出極高的經濟、社會以及感情等代價，不但會降低患者的生活品質、威脅其生命安全，同時也會影響患者家庭和諧以及社會穩定[10]。當前，隨著工作壓力及生活壓力不斷加重，抑郁癥發病率不斷升高且呈現出日益年輕化的特點，因此，加強抑郁癥篩查和診療對于改善患者生命健康有重要價值。

BDNF為分布于大腦皮質及海馬部位的蛋白，與記憶形成存在密切關聯，可與受體TrkB結合并在神經元生長、發育及分化過程中發揮重要作用，對神經可塑性以及神經元網絡形成均可產生重要影響，可發揮理想的抗抑郁作用[11-13]。BDNF能夠使運動神經元存活以及功能得到有效維持，能夠促進中樞神經系統神經細胞合成，此外，對神經細胞損傷修復以及生長發育均可產生促進作用，BDNF高表達作用主要體現于海馬區及皮層部位，抑郁癥患者額前葉及海馬部位BDNF水平低于常人[14-15]。

海馬為記憶、學習以及情緒的綜合認知體，一旦發生強烈和長期應激極易導致海馬區神經數目減少并造成海馬受損，進而使得海馬體積縮小、神經元缺失[16-18]。不同應激狀態對海馬可產生不同的影響，慢性溫和應激可導致海馬組織結構發生器質性變化，急性應激則無法使海馬形態結構發生變化[19-20]。此次研究中，試驗組大鼠自主活動次數明顯較模型組多，模型組大鼠不動時間明顯較參照組及試驗組長，試驗組大鼠不動時間明顯長于參照組大鼠。模型組大鼠Morris水迷宮定位航行實驗結果顯示潛伏期第1～4天均明顯長于參照組，試驗組大鼠均明顯短于模型組。模型組Morris水迷宮空間探索實驗穿臺次數明顯少于參照組，試驗組穿臺次數明顯多于參照組。模型組大鼠TrkB及BDNF蛋白陽性細胞占比均顯著低于參照組及試驗組，試驗組大鼠TrkB及BDNF蛋白陽性細胞占比較參照組低，提示BDNF與其受體缺失及海馬神經元萎縮、凋亡等存在關聯，并易誘發抑郁癥。此外，帕羅西汀片還能夠對海馬CA3區BDNF與受體TrkB蛋白產生調節作用，從而能夠取得抑郁癥改善效果[21]。

綜上所述，帕羅西汀片能夠有效改善抑郁癥大鼠抑郁癥狀，同時還有助于提高大鼠記憶能力及學習能力，作用機制可能與該藥物能夠對海馬CA3區TrkB及BDNF蛋白表達發揮上調作用等相關。

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（收稿日期：2019-10-18）