酒制女貞子生產工藝研究

何娥英 胡中盛 殷久和 孫蒙蒙*

1.安徽滬譙醫藥有限公司，安徽 亳州 236800；2.亳州市滬譙藥業有限公司，安徽 亳州 236800

女貞子為木犀科植物女貞的干燥成熟果實。其最早記錄在《神農本草經》，性涼，味甘、苦，歸肺、肝、腎經，主要產收于我國浙江、安徽、湖南、江蘇等地[1-2]，果實一般在冬季成熟，采收時除去枝葉，然后放入沸水中略微燙后或者放于鍋中稍蒸，干燥。女貞子的最初炮制見于宋代“飯上蒸”(《瘡瘍》)；其次，明代有用酒、旱蓮草及地黃制(《蒙荃》)、酒浸蒸曬(《通玄》)、酒拌黑豆蒸九次(《打法》)、酒拌(《醒齋》)、酒蜜拌蒸暴露七日夜(《瑤函》)等方法[3]。

中藥女貞子中主要活性成分之一是環烯醚萜類化合物，以裂環環烯醚萜類為主，主要化合物包括女貞苷、特女貞苷等[4]。女貞子中的紅景天苷具有調節免疫、抗炎等作用，特女貞苷具有抗腫瘤作用，女貞苷 G13 具有抗骨質疏松作用[5-6]。HUANG X J 等[7]首次從女貞子中分離得到 1α 構型環烯醚萜，并解釋了該化合物成分的生物合成途徑，進一步豐富了女貞子中環烯醚萜類化合物的種類。女貞子生品中環烯醚萜類化合物特女貞苷含量較高，使其保肝利膽、抗腫瘤、降血脂等作用顯著，酒制后，由于特女貞苷在高溫和水蒸氣條件下不穩定，水解生成苯乙醇類化合物紅景天苷，增強了女貞子抗心肌缺血、抗肝、腎纖維化的作用，女貞子酒制后滋補肝腎作用顯著與炮制過程中環烯醚萜類成分發生水解轉化關系密切[8]。通過肖薇等[9]對女貞子生品、醋制女貞子、鹽制女貞子和酒制女貞子的研究分析，比較反相高效液相色譜中不同炮制規格女貞子的有效成分齊墩果酸和特女貞苷進行含量對比，結果顯示生品女貞子和3種不同炮制品中齊墩果酸有效含量高低順序為女貞子生品<醋制女貞子<鹽制女貞子<酒制女貞子。3種不同炮制方法得到的樣品和生品女貞子中特女貞苷含量排列順序為醋制女貞子<酒制女貞子<生品女貞子<鹽制女貞子，說明女貞子的不同炮制方法對其主要有效成分齊墩果酸和特女貞苷的含量具有一定程度的影響。使用數控蒸煮鍋為蒸制設備采用L9(34)的正交實驗設計[10]，以有效成分特女貞苷的含量和酒蒸后女貞子外觀質量為檢測指標，找出適合酒制女貞子的生產工藝參數。

1 儀器與試藥

1.1 實驗儀器 賽默飛U300高效液相色譜儀(檢測器：紫外檢測器)、SK8200B型數控超聲清洗器(上?？茖С晝x器有限公司)、GB/T26497型萬分之一分析天平(奧素斯儀器有限公司)、DZKW-4型電子恒溫水浴鍋(北京中興偉業儀器有限公司)、萬能高速粉碎機(上海道宏商貿有限公司)、數控中藥蒸煮鍋(康華制藥機械有限公司)。

1.2 藥品與試藥 特女貞苷對照品(批號為39011-92-2)供含量測定用；甲醇為一級色譜純(天津四友)；水為純化水；稀乙醇為分析純；女貞子藥材購于安徽省滁州市皇浦藥材棧；黃酒采購于亳州市恒碩發酵制品有限責任公司，酒精度數≥10 Vol。

2 實驗方法

2.1 特女貞苷含量測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱：依利特Hypersil ODS2 250 mm×4.6 mm，5 μm，填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠；流動相：甲醇—水(40∶60)；檢測波長：224 nm。流速：1.0 mL/min；柱溫：25℃。

2.1.2 對照品溶液制備 精密稱取特女貞苷對照品適量于容量瓶中，加入甲醇配制成每毫升含0.25 mg特女貞苷的對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 精密稱定粉碎后的女貞子藥材粉末(過三號篩)0.5 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇50 mL，稱定重量，連接冷凝管加熱回流1 h，放涼，再次稱定重量，用稀乙醇補足減少的重量，搖勻，過濾，取續濾液，即可得到制備的供試品溶液。

2.1.4 樣品測定 分別精密吸取供試品溶液10 μL與對照品溶液5 μL，注入液相色譜儀中，按照4.1.1高效液相色譜法的測定的條件，測定，然后計算女貞子藥材中特女貞苷的含量[4]。

2.2 方法學考察

2.2.1 標準曲線的繪制 分別精密量取 4.1.2 所制備的特女貞苷對照品溶液各1 μL、2 μL、3 μL、4 μL、5 μL注入高效液相色譜儀中按照高效液色譜法進行測定，記錄各個不同進樣體積下測得的特女貞苷的峰面積數值，橫坐標為進樣量(μg)、縱坐標為峰面積，用特女貞苷標準曲線數據繪制標準曲線圖，確定線性范圍。由圖1、圖2可知特女貞苷標準曲線回歸方程為：y=790.45x+31066，R2= 0.99762,說明進樣量在0.2954～1.4770 μg線性良好。

2.2.2 精密度實驗 精密量取 4.1.2 所制備的特女貞苷對照品溶液5 μL，重復進樣5次注入高效液相色譜儀中按照高效液色譜法測定，記錄特女貞苷的峰面積，并計算RSD值小于3 %，說明特女貞苷含量測定方法精密度良好。

2.2.3 重現性實驗用分析 天平精密稱取粉碎后的酒女貞子藥材粉末(過3號篩)0.5 g，平行稱取5份，按照上述供試品溶液制備方法，制備所需要的供試品溶液，用高效液相色譜法測定，進樣10 μL。計算RSD和特女貞苷的平均含量。

2.2.4 穩定性實驗 取粉碎后的女貞子藥材粉末0.5 g，按照上述供試品溶液制備方法，制備所需要的供試品溶液，然后用高效液相色譜法測定特女貞苷的含量在供試品溶液中的含有量，每次間隔一個小時進樣一次，連續進樣9次，記錄峰面積積分，測得特女貞苷含量，計算RSD值小于3 %，說明特女貞苷含量測定中供試品溶液在8 h之內穩定性良好。

2.2.5 加樣回收率實驗 取已測得特女貞苷含量平均值為3.160 %的女貞子藥材，粉碎后過3號篩，平行稱取5份粉末，每份約0.5 g，5份粉末中各加入精密稱定的特女貞苷對照品1 mL，依照《中國藥典》(2015年版)有關供試品溶液制備的方法，制備供試品溶液，按照高效液相色譜法測定供試品溶液中特女貞苷的含量，記錄峰面積，計算分析加樣回收率平均值為98.2%，RSD=0.8105%。

3 實驗結果

3.1 單因素考察試驗 本實驗考察潤法中悶潤時間對女貞子藥材性狀的影響，稱取女貞子藥材4份每份100 g，加相同稀釋倍數的黃酒，分別悶潤0.5 h、1 h、1.5 h、2 h，觀察女貞子藥材性狀。蒸法中蒸制溫度以及蒸制時間對藥材性狀的影響，分別稱取女貞子藥材4份，每份100 g，蒸制溫度分別為100 ℃、105 ℃、110 ℃、115 ℃，蒸制時間分別為4 h、6 h、8 h、10 h，觀察藥材性狀。干燥法中不同干燥溫度對藥材性狀的影響，干燥溫度分別為陰干、60 ℃、80 ℃、100 ℃，觀察藥材性狀。見表1。

由表1可知，悶潤時間以1 h為宜；酒蒸后女貞子的外觀性狀與蒸制時間和蒸制溫度存在顯著性的影響；藥材的性狀與干燥溫度不存在顯著性影響，考慮生產成本與效率選擇在80℃下干燥。

表1 單因素考察藥材性狀表

3.2 正交試驗

3.2.1 正交試驗設計 按照《中國藥典》(2015年版)關于女貞子藥材的炮制是依照酒燉法或酒蒸法使酒吸盡或蒸透，蒸得的藥材顯黑褐色或灰黑色，聞之有酒香氣，有的上面還附白色的粉霜，但是沒有確切的規定蒸制所需要的時間。部分文獻報道的蒸制時間有2 h、3 h、4 h、6 h、8 h，甚至有3 d者[11]。調查研究發現，酒蒸女貞子的質量與悶潤時間、加酒量、蒸制時間、蒸制溫度、干燥溫度存在很重要的關系，且蒸制時間在4 h以上，才能滿足《中國藥典》(2015年版)對女貞子炮制的規定標準[12]。實驗選取悶潤時間、蒸制時間、蒸制溫度和干燥溫度作為4個主要考察因素，各設定3個水平，采用L9(34)正交設計表進行正交實驗。因素水平見表2。以特女貞苷含量為考察指標。取凈女貞子一定量共9份，按表7設計依次進行試驗，試驗結果見表3。

表2 正交試驗因素水平表

3.2.2 正交試驗結果及分析 由表3通過R值比較可知，影響酒制女貞子的最關鍵因素是蒸制時間，次要因素是拌黃酒后的潤制時間，最次要因素為蒸制溫度和干燥溫度。綜合酒制女貞子成品的外觀性狀和特女貞苷的含量(以干燥品計)，優選出最佳的生產工藝條件為A1B2C2D2，即拌黃酒后悶潤1 h，蒸制溫度110 ℃，蒸制時間8 h，80 ℃下干燥。

表3 酒制女貞子正交工作安排及試驗結果

4 討論

本研究考察了酒女貞子炮制過程中的潤制、蒸制和干燥的指標性成分的變化，采用單因素試驗、正交試驗等方法優選最佳工藝。

性狀變化方面，女貞子經酒蒸后顏色較原藥材加深變為黑褐色或灰黑色，可能的原因是女貞子中含有的特女貞苷為環烯醚萜苷類，易水解，苷元聚合而變黑造成的。

指標成分變化方面，隨著潤制時間、蒸制時間和蒸制溫度的增加，特女貞苷含量逐漸降低，原因是特女貞苷含有紅景天苷母核，其性質不穩定，在高溫作用下可使其水解生成次級苷——紅景天苷，進一步水解生成紅景天苷的苷元——酪醇。

炮制過程中參數控制方面，需要重點關注潤制時間和蒸制時間。潤時間過長會引起女貞子果皮破裂，可能也會影響女貞子有效成分含量，潤時間過短會有干心，果皮稍硬，酒浸不透。蒸制時間過長女貞子呈黑褐色或灰黑色，但有效成分含量可能會降低，蒸制時間過短，藥材性狀達不到規定要求。而干燥溫度對藥材性狀影響不大。

5 結論

本研究的目標是為確定酒制女貞子的生產工藝參數，實驗以特女貞苷含量和酒蒸后女貞子成品外觀性狀為指標，通過比較得出，酒女貞子的最佳工藝參數為，拌黃酒后潤1 h，110 ℃蒸制8 h，停止加熱，燜一夜，出鍋，80 ℃下干燥。研究過程中，結合實際生產經驗設定符合酒女貞子炮制的關鍵節點進行考察，通過科學的實驗設計進行參數優選，并在炮制終點判斷時關注性狀變化和指標成分含量變化的平衡，特別是性狀的判斷貫穿整個考察過程，在此基礎上，結合特女貞苷的含量變化，確保炮制所得的酒女貞子性狀和均含量符合中國藥典的要求。所得工藝參數可行性良好，適合大生產操作。